Factors implicats a l’estructura de l’heterocromatina constitutiva pericèntrica

Abstract

La cromatina és una estructura nucleoproteïca dinàmica i jeràrquicament organitzada dins del nucli cel·lular. Segons la seva funcionalitat, la cromatina es pot classificar en dos tipus de regions: l’eucromatina, també anomenada cromatina activa; i l’heterocromatina, que es coneix com a cromatina inactiva. A la seva vegada, l’heterocromatina es pot dividir en dues formes principals en funció de la seva dinàmica funcional, l’heterocromatina facultativa (HF) i l’heterocromatina constitutiva (HC). L’HF es refereix a regions condensades que es troben transcripcionalment inactives però que es poden descompactar per revertir a eucromatina i permetre la transcripció sota determinats contexts específics. Mentre que l’HC es refereix a regions fortament condensades que es troben permanentment silenciades, i que es caracteritzen per tenir baixa densitat gènica i per ser riques en seqüències repetitives d’ADN. Aquestes regions, tenen un rol principalment estructural i són molt importants pel manteniment de l’estabilitat genòmica. Les regions més extenses de l’HC són les regions d’heterocromatina constitutiva pericèntrica (HPC), situades al voltant de la regió centromèrica i vitals per a la formació del cinetocor durant el procés de segregació cromosòmica. D’aquesta manera, l’organització i manteniment de les regions d’HPC és de gran importància per assegurar l’estabilitat genòmica. Ja que l’alteració de la seva estructura condueix a la inestabilitat genòmica, un factor clau en el desenvolupament de moltes patologies humanes com el càncer, les malalties neurodegeneratives, els trastorns cardiovasculars, els trastorns endocrins, i l’envelliment, entre d’altres. HP1 és una proteïna estructural fonamental a les regions d’HPC. En mamífers han estat descrites tres isoformes, HP1α, HP1β i HP1γ. Al llarg del temps s’ha considerat el paper de les isoformes d’HP1 si més no equivalent degut a la forta redundància funcional d’aquestes proteïnes en alguns aspectes concrets. Actualment però, aquesta perspectiva ha canviat, i han estat descrites múltiples funcions específiques de les isoformes d’HP1. Però tot i la seva importància, la contribució específica d’aquestes isoformes a les regions d’HPC no estava ben definida fins al moment. A la primera part d’aquesta tesi s’ha identificat la contribució distintiva de les isoformes d’HP1 a l’estructura i organització de l’HPC. HP1α té un paper directe en la limitació de les marques d’heterocromatina H4K20me3 i H3K27me3 a les regions d’HPC. El nostre treball indica que HP1α té un paper a l’establiment dels dominis cromatínics a aquestes regions per tal d’evitar la propagació de l’heterocromatina a l’eucromatina adjacent, en conjunció amb el principal regulador de l’arquitectura de la cromatina, CTCF, i amb la variant d’histona H2A.Z. La pèrdua d’HP1α resulta doncs en una propagació de les marques heterocromatíniques que donen lloc a una hipercompactació de la cromatina, i que s’associa a un determinat patró de defectes mitòtics com són els defectes merotèlics o sintèlics. Mentre que HP1β es troba vinculada funcionalment amb la metiltransferasa d’histones (HMT) Suv420h2, responsable de la trimetilació d’H4K20, i podria ser la isoforma més implicada en el reclutament d’aquesta a les regions d’HPC per la formació d’una fibra de cromatina compacta.

Conseqüentment, HP1β es relaciona estretament amb la marca H4K20me3 a les regions d’HPC. HP1β sembla també tenir un paper en la restricció de CTCF a posicions específiques tant a les regions d’HPC com a altres regions genòmiques. La pèrdua d’aquesta isoforma indueix descompactació de la cromatina i s’associa amb defectes mitòtics concrets incloent la formació de fus mitòtics multipolars. Finalment, HP1γ sembla tenir un paper intermig de les altres isoformes, el que suggereix una funció més redundant. De manera que, aquest treball ofereix una visió de les funcions de les isoformes d’HP1 a les regions d’HPC i la seva implicació al manteniment de l’estabilitat genòmica. Durant l'última dècada, les desacetilases d’histones (HDACs) de tipus III, conegudes com sirtuïnes, han emergit com a factors clau en el manteniment de la integritat genòmica, són proteïnes NAD+ cofactor dependents i d’aquesta manera poden actuar con a sensors d’estrés i participar de la comunicació entre l’ambient cel·lular i el genoma. Evidències prèvies del grup definien que SirT1 té un paper clau al manteniment de l’estructura de l’HPC, especialment sota condicions d’estrés. En aquestes condicions, es produeix un increment dels nivells de SirT1, aquest interacciona amb Suv39h1 i l’estabilitza evitant la poliubiquitinització mediada per MDM2 de Suv39h1, incrementant la seva vida mitjana i augmentant els nivells de proteïna. L’increment de la disponibilitat de Suv39h1 all nucli, s’ha associat amb un augment del recanvi i de la seva mobilitat a l’HPC, assegurant el manteniment d’H3K9me3 i d’HP1, i la protecció genòmica a les regions d’PCH. Ha estat descrit un antagonisme funcional entre SirT1 i PARP1 respecte el control d’H3K9me3 i d’HP1 a l’HPC, però encara no es coneixia el mecanisme d’acció ni les relacions entre els factors implicats. Els resultats de la segona part d’aquesta tesi han corroborat l’antagonisme funcional de SirT1 i PARP-1 respecte H3K9me3 a les regions de l’HPC, i mostren que aquest antagonisme funcional és degut a una regulació per part d’aquestes dues proteïnes dels nivells de Suv39h1, l’HMT responsable de l’establiment d’H3K9me3 a les regions d’HPC. SirT1 produeix un increment dels nivells de Suv39h1 a través de la seva estabilització, mentre que PARP-1 té un efecte contrari compensatori de la regulació per part de SirT1. Per poder aprofundir en l’estudi d’aquesta relació i degut a que avui dia no existeix cap anticòs fiable de Suv39h1 que funcioni per estudiar la seva localització o el seu enriquiment a la cromatina, en aquest treball s’ha generat i caracteritzat una línia cel·lular de ratolí que té el gen Suv39h1 taggejat endògenament mitjançant la tècnica CRISPR/Cas9.