Efectos de la fotoestimulación en el semen de burro y caballo

Abstract

Estudis previs realitzats en altres espècies, han demostrat que la fotoestimulació amb llum vermella augmenta la motilitat espermàtica. A més, altres estudis indiquen que la capacitat fecundant dels espermatozoides pot incrementar després de la irradiació. Tot i que els mecanismes a través dels quals la llum exerceix els seus efectes sobre els espermatozoides es desconeixen en gran mesura, l'evidència creixent atorga als fotosensibilitzadors cel·lulars endògens, especialment els presents en les mitocòndries, un paper fonamental.

Per tot això, l'objectiu d'aquesta tesi doctoral va ser avaluar els efectes de diferents protocols de fotoestimulació amb un llum LED vermella a una longitud d'ona de 620-630 nm sobre els paràmetres de qualitat espermàtica, en semen de ruc i cavall; fresc, refrigerat i congelat/descongelat, a més d'avaluar la influència del medi i del color de la palleta utilitzada en els efectes observats, i determinar si els efectes produïts per l'estimulació amb llum vermella en els espermatozoides estan provocats per canvis en la funció mitocondrial induïts per l'acció de la llum sobre els citocroms mitocondrials com el citocrom C.

Amb aquest propòsit es van dissenyar cinc estudis: en el primer es van avaluar els efectes de diferents patrons d'estimulació amb llum LED vermella sobre els paràmetres de motilitat espermàtica, la integritat de la membrana, el potencial de membrana mitocondrial i els nivells intracel·lulars de ROS en semen de ruc fresc i refrigerat. En el segon estudi es van analitzar els efectes de diferents patrons d'irradiació amb llum vermella sobre la motilitat espermàtica, les subpoblacions d'espermatozoides mòbils, el potencial de membrana mitocondrial, la taxa de consum d'O2, els nivells intracel·lulars d'ATP, la integritat de la membrana i la integritat de l'ADN espermàtic en semen fresc de cavall. El tercer estudi tenia com objectiu determinar si la irradiació amb llum vermella de l’esperma de cavall congelada-descongelada podria millorar la qualitat espermàtica i augmentar la seva capacitat de resistir la incubació a 38 °C per 120 minuts. En el quart estudi, es va examinar si el color de la palleta i / o la terbolesa del medi utilitzat per a la refrigeració del semen afectaven a la resposta induïda per l'estimulació amb llum vermella en el semen de cavall refrigerat. Finalment, en el cinquè treball es va estudiar si els efectes produïts per la fotoestimulació estaven relacionats amb canvis en la funció mitocondrial induïts sobre els citocroms mitocondrials, com el citocrom C.

Els resultats obtinguts en aquesta Tesi Doctoral indiquen que la irradiació dels espermatozoides de ruc i cavall amb llum LED vermella modifica alguns paràmetres de motilitat espermàtica, l'estructura de les subpoblacions d'espermatozoides mòbils, la taxa de consum d'O2, l'activitat de la citocrom C oxidasa i els nivells intracel·lulars de ROS, sense afectar la integritat de la membrana plasmàtica, l'acrosoma o l'ADN espermàtic, millorant a més la seva resiliència a l'estrès tèrmic. Aquests efectes varien segons el temps i el patró d'exposició, l'espècie, el tipus de semen, el color de la palleta i la terbolesa del medi utilitzat.

En conclusió, aquesta Tesi Doctoral mostra que la irradiació dels espermatozoides de ruc i cavall amb llum LED vermella (620-630 nm) és un mètode segur que produeix una millora sobre alguns paràmetres de qualitat espermàtica en el semen de burro i cavall, efectes que estan relacionats amb l'acció de la llum sobre els fotosensibilitzadors mitocondrials, com el citocrom C que modifica l'activitat de la cadena d'electrons mitocondrial. Així, la fotoestimualació podria tenir un impacte positiu en el rendiment reproductiu i en les tecnologies de reproducció assistida en aquestes espècies, així com també en la conservació del semen.

Estudios previos realizados en otras especies, han demostrado que la estimulación con luz roja aumenta la motilidad espermática. Además, otros estudios han sugerido que la capacidad fecundante de los espermatozoides puede incrementarse después de la irradiación. Aunque los mecanismos a través de los cuales la luz ejerce sus efectos sobre los espermatozoides se desconocen en gran medida, la evidencia creciente otorga a los fotosensibilizadores celulares endógenos, especialmente los presentes en las mitocondrias, un papel crucial.

Por todo ello, el objetivo de esta Tesis Doctoral fue evaluar los efectos de diferentes protocolos de fotoestimulación con un luz LED roja a una longitud de onda de 620-630 nm sobre los parámetros de calidad espermática, en semen de burro y caballo; fresco, refrigerado y congelado/descongelado, además de evaluar la influencia del medio/diluyente y del color de la pajuela utilizada en los efectos observados, así como estudiar si los efectos producidos por la estimulación con luz roja en los espermatozoides están provocados por cambios en la función mitocondrial inducidos por la acción de la luz sobre los citocromos mitocondriales como el citocromo C.

Con este propósito, se diseñaron cinco estudios: en el primero se evaluaron los efectos de diferentes patrones de estimulación con luz LED roja sobre los parámetros de motilidad espermática, la integridad de la membrana plasmática, el potencial de membrana mitocondrial y los niveles intracelulares de ROS en semen de burro fresco y refrigerado. En el segundo estudio, se analizaron los efectos de diferentes patrones de irradiación con luz roja sobre la motilidad espermática, las subpoblaciones de espermatozoides móviles, el potencial de membrana mitocondrial, la tasa de consumo de O2, los niveles intracelulares de ATP, la integridad de la membrana plasmática y la integridad del ADN espermático en semen fresco de caballo. En el tercer estudio se propuso determinar si la irradiación con luz roja del semen de caballo congelado-descongelado podría mejorar la calidad espermática y aumentar su capacidad de resistir al estrés térmico. En el cuarto estudio se examinó si el color de la pajuela y/o la turbidez del diluyente utilizado para la refrigeración del semen afectaba a la respuesta inducida por la estimulación con luz roja en semen de caballo refrigerado. Finalmente, en el quinto trabajo se estudió si los efectos producidos por la fotoestimulación estaban relacionados con cambios en la función mitocondrial inducidos sobre los citocromos mitocondriales, como el citocromo C.

Los resultados presentados en esta Tesis Doctoral indican que la irradiación de los espermatozoides de burro y caballo con luz LED roja modifica algunos parámetros de motilidad espermática, la estructura de las subpoblaciones de espermatozoides móviles, la tasa de consumo de O2, la actividad de la citocromo C oxidasa y los niveles intracelulares de ROS, sin afectar a la integridad de la membrana plasmática, el acrosoma o el ADN espermático, mejorando además su resiliencia al estrés térmico. Estos efectos varían según el tiempo y patrón de exposición, la especie, el tipo de semen, el color de la pajuela y la turbidez del diluyente utilizado.

En conclusión, esta Tesis Doctoral muestra que la irradiación de los espermatozoides de burro y caballo con luz LED roja (620-630 nm) es un método seguro que produce una mejora sobre algunos parámetros de calidad espermática en el semen de burro y caballo, efectos que están relacionados con la acción de la luz sobre los fotosensibilizadores mitocondriales, como el citocromo C que modifica la actividad de la cadena de electrones mitocondrial. Así, la fotoestimulación podría tener un impacto positivo en el rendimiento reproductivo y en las tecnologías de reproducción asistida en estas especies, así como también en la conservación de semen.

Previous studies carried out in other species, showed that stimulating sperm with red light increases their motility. In addition, other studies indicate sperm fertilizing ability can be increased after irradiation. While the mechanisms through which light exerts its effects on sperm are largely unknown, mounting evidence gives endogenous cellular photosensitizers, especially those present in mitochondria, a crucial role.

Therefore, the objective of this Dissertation was to evaluate the effects of different irradiation protocols using a red LED light at a wavelength of 620-630 nm on freshly ejaculated, liquid-stored and frozen-thawed sperm from stallions and jackasses. The potential influence of the medium/extender and the colour of the straw was also investigated, as well as whether the effects produced by red light resulted from changes in mitochondrial function via modulation of cytochromes, such as cytochrome C.

For this purpose, five studies were designed. In the first one, the effects of different red LED light patterns on sperm motility, integrity of plasma membrane, mitochondrial membrane potential, and intracellular ROS levels were investigated in fresh and stored donkey semen. The second study analysed the effects of separate red light irradiation patterns on motility, membrane integrity, motile sperm subpopulations, mitochondrial membrane potential, O2 consumption rate, intracellular ATP levels and the integrity of DNA of fresh horse sperm. The third study sought to determine whether red light irradiation of frozen-thawed horse semen could improve sperm quality and increase their ability to withstand incubation. In the fourth study, whether the colour of the straw and / or the turbidity of the medium affected the response induced by red light stimulation was examined in liquid-stored horse semen. Finally, the fifth work studied whether the effects produced by red light on sperm were related to changes in mitochondrial function induced by mitochondrial cytochromes, such as cytochrome C.

The results shown in this Dissertation indicate that irradiation of donkey and horse sperm with red LED light modifies their sperm motility, the structure of motile sperm subpopulations, the rate of O2 consumption, the activity of cytochrome C oxidase and intracellular levels of ROS, without affecting the integrity of plasma membrane and acrosome or sperm DNA. In addition, stimulation with red light also improves the sperm resilience to thermal stress. These effects vary according to the time and pattern of exposure, species, type of semen, colour of the straw and the turbidity of the medium.

In conclusion, this Dissertation supports that irradiation of donkey and horse sperm with red LED light (620-630 nm) is a safe method that may improve some sperm quality parameters in donkey and horse semen. These effects are related to the action of light on mitochondrial photosensitizers, such as cytochrome C, which modifies the activity of the mitochondrial electron chain. Therefore, irradiation of sperm with red light could have a positive impact on reproductive performance and assisted reproductive technologies in these species, as well as on semen preservation.