Characterization of the functional connection between the BROMODOMAIN and EXTRATERMINAL DOMAIN PROTEIN 9 (BET9) and the circadian clock in Arabidopsis thaliana

Abstract

The circadian clock is an endogenously generated timekeeping mechanism that generates 24-hour rhythms in multiple biological processes. The rhythmic oscillations provide an adaptive advantage, allowing organisms to anticipate and adjust to the environmental changes that occur during the day and night cycle. The generation of the rhythms rely on the oscillations in gene expression and protein function at the core of the oscillator. Over the last years, changes in chromatin marks have been identified as an important mechanism contributing to the rhythmic oscillations. However, we are still far from the identification of the chromatin-related components that are responsible for the rhythmic regulation of these chromatin changes. In this Doctoral Thesis, we have characterized the function of the BROMODOMAIN AND EXTRA- TERMINAL DOMAIN 9 (BET9) protein within the Arabidopsis thaliana circadian clock. We have identified the rhythmic oscillation of BET9 expression, which is controlled by the binding of the clock activator known as REVEILLE 8 (RVE8) to the BET9 promoter. Characterization of bet9 mutant plants and lines over- expressing BET9 (BET9-ox) showed that BET9 functions as an activator of clock gene expression. Chromatin immunoprecipitation assays (ChIP) also showed that BET9 directly binds to the promoters of essential clock genes such as TIMING OF CAB2 EXPRESSION 1 (TOC1) and PSEUDO RESPONSE REGULATOR 5 (PRR5). Increased binding of BET9 to these promoters in BET9-ox plants correlated with increased HISTONE 3 acetylation at the TOC1 promoter, and conversely, with hypoacetylation in the bet9 mutant. Genetic interaction studies showed that BET9 requires a functional RVE8, as the BET9-ox gene expression phenotypes and BET9 binding to the gene target promoters were abolished in the rve8 mutant background. Our studies have thus uncovered a chromatin-related protein that together with RVE8 contributes to the activation of clock gene expression.

El reloj circadiano es un mecanismo endógeno que genera ritmos de 24 horas en múltiples procesos biológicos. Las oscilaciones rítmicas proporcionan una ventaja adaptativa, permitiendo a los organismos anticipar y ajustarse a los cambios ambientales que ocurren en el ciclo de día-noche. La generación de los ritmos se basa en las oscilaciones rítmicas de expresión génica y función de proteínas del oscilador circadiano. En los últimos años, los cambios en marcas de cromatina se han identificado como un mecanismo importante que contribuye a las oscilaciones rítmicas. Sin embargo, estamos aún lejos de la identificación de todos los componentes relacionados con la cromatina que son responsables de la regulación rítmica de estos cambios de cromatina. En la presente Tesis Doctoral, se describe la caracterización de la función de la proteína BROMODOMAIN AND EXTRA-TERMINAL DOMAIN 9 (BET9) en el reloj circadiano de Arabidopsis thaliana. Hemos identificado la oscilación rítmica de la expresión BET9, que está controlada por la unión del activador de reloj denominado REVEILLE 8 (RVE8) al promotor de BET9. La caracterización de plantas mutantes de bet9 y líneas que sobre-expresan BET9 (BET9-ox) mostró que BET9 funciona como un activador de la expresión génica del reloj. Los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) también mostraron que BET9 se une directamente a los promotores de genes de reloj esenciales como TIMING OF CAB2 EXPRESSION 1 (TOC1) y PSEUDO RESPONSE REGULATOR 5 (PRR5). Observamos que el aumento de la unión de BET9 a estos promotores en plantas BET9-ox se correlacionaba con el aumento de la acetilación de la HISTONA 3 en el promotor de TOC1 y, a la inversa, con la hipoacetilación en el mutante bet9. Los estudios de interacción genética mostraron que BET9 requiere un RVE8 funcional, ya que los fenotipos de expresión génica de plantas BET9-ox y la unión de BET9 a los promotores diana quedaban abolidos en el fondo mutante rve8. Por tanto, nuestros estudios han descubierto una proteína relacionada con la cromatina que junto con RVE8 contribuyen a la activación de la expresión génica del reloj.