Impacto de SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) sobre la homeostasis del calcio intracelular y la actividad eléctrica en miocitos auriculares humanos

Abstract

ANTECENDENTES: La fibrilación auricular (FA) es la arritmia más común, afectando a un 1-2% de la población general. Aunque la FA se ha asociado con numerosas alteraciones electrofisiológicas, moleculares y estructurales, su tratamiento no es eficaz en todos los pacientes. Desde hace una década, diversos estudios de “genome wide association” han asociado varios single nucleotide polymorphisms (SNP)s en las regiones cromosómicas 4q25, 1q21 y 16q22, entre otras, a un mayor riesgo de presentar FA. No obstante, los mecanismos que están detrás de cada uno de ellos todavía son desconocidos. Por otro lado, varios estudios han demostrado que factores como tener enfermedad en la válvula mitral, la edad o la función del ventrículo izquierdo pueden afectar a la homeostasis intracelular del calcio y a la actividad eléctrica en miocitos auriculares humanos. Sin embargo, aunque hay estudios que demuestran que la epidemiología de la FA es diferente entre hombres y mujeres, sólo se ha analizado el efecto del sexo sobre la homeostasis intracelular del calcio en modelos animales. HIPÓTESIS: La asociación específica de los diferentes SNPs con mecanismos moleculares y consecuencias electrofisiológicas concretas podría ser utilizada como biomarcador para la prevención del desarrollo de FA, así como para el tratamiento personalizado de pacientes teniendo en cuenta el efecto del sexo. OBJETIVOS:

• Profundizar en los mecanismos moleculares que alteran la homeostasis del calcio en los portadores de múltiples variantes de riesgo de la región 4q25. • Investigar el efecto que tienen las variantes de riesgo de la región 1q21 sobre la corriente SK3 y la actividad eléctrica, así como la influencia de la homeostasis del calcio sobre la corriente SK3 en miocitos auriculares humanos. • Analizar las posibles interacciones que se pueden dar entre las diferentes variantes de riesgo 4q25 y 1q21, y cómo afectarían estas a la función de los miocitos auriculares humanos. • Determinar la influencia del sexo en la homeostasis intracelular del calcio en pacientes con FA.

MÉTODOS: Los experimentos se llevaron a cabo en miocitos auriculares humanos aislados. Se utilizó la técnica de patch-clamp (voltaje-clamp o current-clamp en función del protocolo) para medir la corriente de calcio (ICa) y sus características electrofisiológicas, así como las corrientes transitorias de entrada (ITI) o las despolarizaciones espontáneas de membrana. Para visualizar el calcio intracelular se utilizó microscopia confocal. La expresión de proteínas se determinó mediante la técnica de western blot y su distribución se analizó con marcaje inmunofluorescente

RESULTADOS: El análisis del efecto de múltiples variantes de riesgo de 4q25 sobre la ICa y la actividad eléctrica en miocitos auriculares humanos, mostró que los pacientes portadores de la variante de riesgo en rs1448818 (la más próxima a PITX2) presentaban una reducción significativa de la ICa, mientras que los pacientes portadores de las variantes de riesgo en rs2200733, rs13143308 y rs10033464 (aproximadamente a 150 kb de PITX2) presentaban un incremento significativo en la frecuencia de ITI. Teniendo en cuenta estos hallazgos en conjunto, el efecto parece estar asociado a la localización en la que se encuentran las variantes de riesgo, sugiriéndose un efecto inhibidor en el extremo de 4q25 en la que se encuentra la variante de riesgo rs1448818, y un efecto estimulador en la región central donde se encuentran las variantes de riesgo rs2200733, rs13143308 y rs10033464. Por otro lado, el análisis del efecto de la alteración en la homeostasis del calcio y de las variantes de riesgo 1q21 sobre la corriente SK3 y la actividad eléctrica en miocitos auriculares humanos mostró que los pacientes con FA, los portadores de la variante de riesgo en rs1448818 de 4q25 y los portadores de la variante rs13376333 de 1q21 presentaban una reducción en la corriente SK sensible a apamina. Además, el bloqueo de los canales SK3 con apamina demostró que una disminución de la función de estos se traducía en un incremento de las despolarizaciones espontáneas de la membrana. Finalmente, aunque la FA se ha asociado con una disminución de la ICa y un aumento de la frecuencia de ITI, el análisis del efecto del sexo sobre la homeostasis intracelular del calcio en miocitos auriculares humanos demostró que la ICa sólo se vio reducida en hombres con FA; mientras que permitió observar una mayor incidencia de ITI y despolarizaciones espontáneas de la membrana únicamente en mujeres, exacerbándose en aquellas con FA.

CONCLUSIONES:

1. Las variantes de riesgo de la región 4q25 asociadas a FA tienen un efecto diferencial sobre la regulación del calcio intracelular en función de su localización. • Los pacientes portadores de la variante de riesgo en rs1448818, que se encuentra en el extremo más próximo a PITX2, presentan una reducción de la ICa que favorecería un acortamiento del periodo refractario y la reentrada eléctrica. • Por otro lado, los pacientes portadores de las variantes de riesgo en rs2200733, rs13143308 o rs10033464, situadas a unas 150 kb de PITX2, presentan un incremento en la frecuencia de ITI que favorecería las despolarizaciones espontáneas de la membrana y actividad ectópica. Esto sugiere que la elección del tratamiento para prevenir o tratar la FA debería tener en cuenta las variantes de riesgo que presenta el paciente, ya que sería beneficioso restaurar la ICa en portadores de rs1448818 y reducir la liberación espontánea de calcio en portadores de rs13143308.

2. Las alteraciones en la homeostasis del calcio modifican la corriente SK sensible a apamina. • Así, la reducción de la ICa observada en pacientes con FA o en portadores de la variante de riesgo en rs1448818 reduce la corriente SK sensible a apamina. • Por otro lado, la variante de riesgo rs13376333 de la región1q21, ubicada en el intrón 1 del gen KCNN3, también reduce la corriente SK sensible a apamina. • Los efectos de las variantes de riesgo rs1448818 y rs13376333 no son complementarios. Estas reducciones de la corriente SK3 retrasarían la repolarización de las despolarizaciones espontáneas de membrana, facilitando la inducción de potenciales de acción espontáneos y arritmias inducidas por actividad ectópica. Por tanto, la restauración de la función de los canales SK3 podría ser una terapia farmacológica específica para la prevención o el tratamiento de los pacientes portadores de la variante rs13376333.

3. El sexo es un factor a tener en cuenta ya que tiene un efecto diferencial sobre la ICa y la frecuencia de ITI en miocitos auriculares de pacientes con FA.

• La ICa sólo se ve reducida en hombres con FA. • La incidencia de ITI y despolarizaciones espontáneas de la membrana es mayor únicamente en mujeres. Estos resultados sugieren que las terapias dirigidas a reestablecer la ICa serían más efectivas en hombres con FA, mientras que las terapias dirigidas a reestablecer la actividad del RyR2 serían más efectivas en mujeres con FA.

BACKGROUND: Atrial fibrillation (AF) is the most common arrhythmia, affecting 1-2% of the general population. Although AF has been associated with numerous electrophysiological, molecular and structural alterations, its treatment is not effective in all patients. For a decade, various genome wide association studies have associated several single nucleotide polymorphisms (SNP)s in the chromosomal regions 4q25, 1q21 and 16q22 with an increased risk of developing AF. Nevertheless, the mechanisms behind each of them are still unknown. On the other hand, several studies have shown that clinical factors such as mitral valve disease, age, or left ventricular function can affect intracellular calcium homeostasis and electrical activity in human atrial myocytes. However, although there are studies showing differences in the epidemiology of AF between men and women, the effect of sex on intracellular calcium homeostasis has only been analyzed in animal models. HYPOTHESIS: The specific association of the different SNPs with molecular mechanisms and specific electrophysiological responses could be used as biomarkers for the prevention of AF, as well as for personalized treatment of patients with AF, taking into account the influence of sex. AIMS OF THE THESIS:

• Analyze the molecular mechanisms that alter calcium homeostasis in carriers of multiple risk variants of the 4q25 region. • Investigate the effects of 1q21 risk variants on SK3 current and electrical activity, as well as the influence of calcium homeostasis on SK3 current in human atrial myocytes. • Analyze the possible interactions that can occur between the different 4q25 and 1q21 risk variants, and their combined effect on electrophysiological function of human atrial myocytes. • Determine the influence of sex on intracellular calcium homeostasis in patients with AF.

METHODS: Experiments were carried out on isolated human atrial myocytes. Patch-clamp technique (voltage-clamp or current-clamp depending on the protocol) was used to measure calcium current and its electrophysiological characteristics, as well as transient inward currents (ITI) or spontaneous membrane depolarizations. Confocal microscopy was used to visualize intracellular calcium. Protein expression was determined using the western blot technique and their distribution was analyzed with immunofluorescent marking. RESULTS: Analysis of the effect of all 4q25 risk variants on ICa and electrical activity in human atrial myocytes showed a significant reduction in ICa amplitude in patients carrying the risk variant in rs1448818 (the variant closest to PITX2), while patients carrying the risk variants in rs2200733, rs13143308 and rs10033464 (approximately located 150 kb upstream from PITX2) presented a significant increase in the ITI frequency. Taking these findings into account, the functional effect seems to be associated with the location of the risk variants, suggesting an inhibitory effect on ion channel activity in the region close to PITX2 where the risk variant rs1448818 is found, and a stimulatory effect in the area further away from PITX2 where the risk variants rs2200733, rs13143308 and rs10033464 are found. On the other hand, analysis of the effect of the alterations in calcium homeostasis and 1q21 risk variants on SK3 current and electrical activity in human atrial myocytes showed that patients with AF, carriers of the risk variant rs1448818 and carriers of the risk variant rs13376333 at 1q21 all exhibited a reduction in apamine-sensitive SK current. Furthermore, blocking the SK3 channels with apamin led to an increase in spontaneous membrane depolarizations. Finally, AF has generally been associated with a decrease in ICa and an increase in ITI frequency, but analysis of the effect of sex on intracellular calcium homeostasis in human atrial myocytes showed that ICa is only reduced in men with AF; while higher frequency of ITI and spontaneous membrane depolarizations is only observed in women and exacerbated in those with AF.

CONCLUSIONS:

1. Risk variants in the 4q25 region associated with risk of AF have a differential effect on intracellular calcium regulation depending on their location. • Patients with risk variant at rs1448818, which is closest to PITX2, present a reduction in ICa that would favor a shortening of refractory period and electrical reentry. • On the other hand, patients with risk variants at rs2200733, rs13143308 or rs10033464, located approximately 150 kb upstream from PITX2, present an increase in the ITI frequency that favors spontaneous membrane depolarizations and ectopic activity. This demonstrates that the choice of treatment to prevent or treat AF should take into account the risk variants carried by the patient, suggesting that it would be beneficial to restore ICa in carriers of rs1448818 and to reduce spontaneous calcium release in carriers of rs13143308. 2. Altered calcium homeostasis and 1q21 variants modify the apamine-sensitive current. • The reduction in ICa observed in patients with AF or in carriers of the risk variant in rs1448818 reduces the apamine-sensitive SK current. • The risk variant rs13376333 in the 1q21 region, located in intron 1 of the KCNN3 gene, also reduce the apamine-sensitive current. • The effects of the risk variants rs1448818 and rs13376333 are not complementary. These reductions in SK3 current would delay the repolarization of spontaneous membrane depolarizations, facilitating the induction of spontaneous action potentials and arrhythmias induced by ectopic activity. Therefore, restoration of SK3 channel function might represent a specific therapy for the prevention or treatment of AF in carriers of the rs13376333 risk variant.

3. Sex is also a factor to take into account since it has a differential effect on ICa amplitude and ITI frequency in atrial myocytes of patients with AF. • ICa is only reduced in men with AF. • The incidence of ITI and spontaneous membrane depolarizations is higher in women only and exacerbated in those with AF. These results suggest that therapies aimed at reestablishing ICa would be more effective in men with AF, while therapies aimed at restoring RyR2 activity would be more effective in women with AF.