Identifying molecular mechanisms that determine resistance to CDK4/6 inhibitors in HER2-enriched advanced luminal breast cancer

Abstract

Breast Cancer (BCa) is the most prevalent cancer among women worldwide. It is a very heterogeneous disease at the histological, molecular and clinical level. Consequently, different classifications are used for stratifying patients. The histopathological classification is used in patient clinical management. It is based on the expression of three different markers: Estrogen receptor (ER) and progesterone receptor, both hormone receptors, and the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2). Recent technical advances have developed a novel classification based on the gene expression profile of the tumors. Four intrinsic molecular subtypes are defined by the expression of 50 specific genes, this gene signature is called PAM50. Accordingly, BCa is classified in Luminal A, Luminal B, HER2-enriched (HER2-E) and Basal –like. These subtypes have critical differences in incidence, survival and response to treatment and have a predictive and prognostic value at the treatment level. The histopathological classification and the molecular classification are independent.

In February 2015, the FDA approved a new drug for postmenopausal women with metastatic ER+/HER2-negative BCa, CDK4/6 inhibitors (CDK4/6i). CDK4/6 are serine-threonine kinases that have a key role in cell cycle regulation by allowing S phase progression. These inhibitors have provided clinical improvement in terms of progression-free survival and overall survival compared with endocrine therapy alone. CDK4/6i are now standard of care for treating metastatic ER+ BCa patients. PAM50 has been used to predict benefit from CDK4/6i in retrospective analysis of clinical trials. According to these retrospective analyses, CDK4/6i are only beneficial in luminal A and B. Thus, HER2-E tumors, which were a big proportion of treated tumors, did not benefit from CDK4/6i.

Understanding mechanisms responsible for primary or secondary resistance to CDK4/6i in advanced ER+ BCa is crucial to improve patient outcome. We aim to identify new candidate genes responsible for resistance to palbociclib (CDK4/6i) treatment in the HER2-E intrinsic subtype of ER+/HER2- BCa by combining an unbiased CRISPR-Cas9-based genome-wide screening approach and the analysis of clinical data.

To approach this question, we characterized CDK4/6i response in ER+ BCa cell lines. We determined ER+ BCa cell lines that are palbo-resistant or palbo-sensitive based on palbociclib IC50. Next, we subjected the palbo-resistant cell lines to CRISPR-cas9 sgRNA pooled genome-wide screening. We identified different genes that confer resistance to palbociclib in vitro. In parallel to the unbiased CRISPR/Cas9 knock-out screening, we interrogated which genes were associated with worse resp onse to CDK4/6i using two different patient cohorts (CDK patient cohort and CORALEEN data set). We integrated all 11

the data and we identified eleven common genes out of the three analyses. Nine out of the eleven genes were related to cell cycle progression machinery such as E2F1 and CCNE1, whereas the other two genes were membrane molecules associated with signal transduction. We selected one of these membrane molecules for further validation based on its tight association with HER2-E molecular subtype.

High expression of this gene was associated with worst progression-free survival and overall survival in the CDK patient cohort. The patients that had progression disease presented a higher mRNA level of this resistance driver. Similar observations were found in samples from the CORALEEN clinical trial. Patients that did not respond to CDK4/6i treatment showed an increased expression of this gene. At the cellular level, different in vitro strategies were followed to determine the effect of the expression of this gene in palbociclib response. We developed acquired resistant cell lines from palbo-sensitive MCF7 cells and used them to validate our candidate. Moreover, loss- and gain-of-function approaches confirmed the association of this gene with an increased resistance to palbociclib treatment.

Finally, we study how mechanistically this gene drives resistance to palbociclib. To this end, we interrogated alterations in gene expression of different genes after silencing this membrane protein in different cell lines. We detected reduced CCNE1 expression levels. CCNE1 gene was identified through the CRISPR/Cas9 screen and it was associated with no response and progression disease in both CDK and CORALEEN patient cohorts. Importantly, when we silenced CCNE1 in ZR75 cells we successfully increased CDK4/6i sensitivity. In addition, we optimized a proximity-dependent labeling approach, BioID, in order to describe the interactome of our gene of interest in parental and acquired resistant MCF7 cells. We found interesting downstream signaling transducers to further analyzed as a mechanism of action.

In conclusion, we succeed identifying a new driver of CDK4/6i resistance in ER+/HER2-negative advanced BCa classified as HER2-E molecular subtype.

El cáncer de mama es el tipo de cáncer más prevalente en mujeres en todo el mundo. Es una enfermedad heterogénea a nivel histológico, molecular y clínico. En consecuencia, tenemos diferentes clasificaciones para estratificar las pacientes de cáncer de mama. La clasificación histopatológica es una de las más utilizadas en el manejo clínico del paciente. Se basa en la expresión de tres marcadores diferentes: receptor de estrógeno (ER, por sus siglas en inglés) y receptor de progesterona, ambos receptores de hormonas, y el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2, por sus siglas en inglés). Los avances técnicos recientes han desarrollado una clasificación novedosa basada en el perfil de expresión génica de los tumores. Esta clasificación molecular diferencia cuatro subtipos moleculares intrínsecos, definidos por la expresión de 50 genes específicos (firma genética llamada PAM50). En consecuencia, el cáncer de mama se clasifica en Luminal A, Luminal B, HER2-enriched (HER2-E) y Basal-like. Estos subtipos tienen diferencias críticas en incidencia, supervivencia y respuesta al tratamiento y tienen un valor predictivo y pronóstico a nivel de tratamiento. La clasificación histopatológica y la clasificación molecular son independientes.

En febrero de 2015, la FDA aprobó un nuevo fármaco para mujeres posmenopáusicas con cáncer de mama metastásico ER+/HER2-negativo, los inhibidores de CDK4/6 (CDK4 / 6i). CDK4/6 son serina-treonina quinasas que tienen un papel clave en la regulación del ciclo celular al permitir la progresión a la fase S. Estos inhibidores han proporcionado una mejora clínica en la supervivencia de las pacientes en comparación con la terapia endocrina como monoterapia. Los CDK4/6i son ahora un tratamiento estándar para las pacientes con cáncer de mama metastásicos ER+/HER2-negativo. PAM50 se ha utilizado para predecir el beneficio al tratamiento con CDK4/6i en análisis retrospectivos de diferentes ensayos clínicos. Según estos análisis retrospectivos, CDK4/6i solo es beneficioso en tumores con subtipo molecular Luminal A y B. Por lo tanto, los tumores con subtipo molecular HER2-E, que constituyen una gran proporción de los tumores tratados, no se beneficiaron del tratamiento con CDK4/6i.

Comprender los mecanismos responsables de la resistencia a CDK4 / 6i en cáncer de mama metastasico ER+/HER2-negativo es crucial para mejorar el resultado de las pacientes. Nuestro objetivo es identificar nuevos genes responsables de la resistencia al tratamiento con palbociclib (un CDK4/6i) en tumores de cáncer de mama ER+/HER2-negativos con subtipo molecular HER2-E mediante la combinación de un enfoque de cribado de todo el genoma basado en CRISPR-Cas9 y el análisis de datos clínicos.

Para abordar esta pregunta, caracterizamos la respuesta a CDK4/6i en líneas celulares tumores de cáncer de mama ER+. Determinamos qué líneas celulares ER + BCa son palbo-resistentes o palbo-sensibles basandonos en la IC50 de palbociclib. A continuación, sometimos las líneas celulares resistentes a palbociclib a un cribado de todo el genoma usando la tecnologia CRISPR-Cas9. Identificamos diferentes genes que confieren resistencia a palbociclib in vitro. En paralelo al cribado de CRISPR/Cas9, interrogamos qué genes estaban asociados con una peor respuesta a CDK4/6i utilizando dos cohortes de pacientes diferentes (cohorte de pacientes CDK y conjunto de datos del ensayo clínico CORALEEN). Integramos todos los datos e identificamos once genes comunes de los tres análisis. Nueve de los once genes estaban relacionados con la maquinaria de progresión del ciclo celular, como E2F1 y CCNE1, mientras que los otros dos genes eran moléculas de membrana asociadas con la transducción de señales intracelulares. Seleccionamos una de estas proteínas de membrana para validar su función en generar resistencia a CDK4/6i basándonos en su estrecha asociación con el subtipo molecular HER2-E.

Altos niveles de este gen se asociaron a peor supervivencia en la cohorte de pacientes CDK. Los pacientes que tenían enfermedad en progresión presentaron un nivel de ARNm de este gen más elevado. Se encontraron observaciones similares en muestras del ensayo clínico CORALEEN. Los pacientes que no respondieron al tratamiento con CDK4/6i mostraron un aumento de la expresión de nuestro gen de interés. A nivel celular, se siguieron diferentes estrategias in vitro para determinar el efecto de la expresión de este gen en la respuesta de palbociclib. Desarrollamos líneas celulares con resistencia adquirida a palbociclib a partir de células MCF7 sensibles y las usamos para validar nuestro candidato. Además, los enfoques de pérdida y ganancia de función confirmaron la asociación de nuestro candidato con una mayor resistencia al tratamiento con palbociclib.

Finalmente, estudiamos el mecanismo por el cual este gen induce la resistencia a palbociclib. Con este fin, investigamos las alteraciones en la expresión génica de diferentes genes después del silenciamiento del gen en diferentes líneas celulares. Detectamos niveles reducidos de expresión de CCNE1 al silenciar nuestro candidato. El gen CCNE1 se identificó mediante el cribado CRISPR/Cas9 y se asoció con resistencia a CDK4/6i y con progresión de la enfermedad en ambas cohortes de pacientes CDK y CORALEEN. Es importante destacar que cuando silenciamos CCNE1 en células ZR75 aumentamos la sensibilidad a CDK4/6i. Además, optimizamos un enfoque de marcaje por proximidad, BioID, para describir el interactoma del gen que genera resistencia a CDK4/6i en células MCF7 parentales y con resistencia adquirida. Encontramos proteínas interesantes que participan en la transducción de señales intracelulares. Estos mecanismos tienen que ser analizarlos más a fondo.

En conclusión, logramos identificar un nuevo mecanismo de resistencia a CDK4/6i en cáncer de mama metastásico ER+/HER2-negativo con el subtipo molecular HER2-E.