Novel biocatalytic approaches for the valorization of furfural and 5-hydroxymethylfurfural

Abstract

L'actual dependència en els recursos fòssils per a produir energia i productes químics suposa una gran preocupació mediambiental. Trobar alternatives renovables és crucial per sostenir la vida futura al planeta Terra. La biomassa, específicament en forma de lignocel·lulosa, és una alternativa prometedora perquè és abundant com a residu i és la font de carboni més copiosa de la planeta, contenint altes quantitats de sucres en forma de cel·lulosa i hemicel·lulosa. Els monosacàrids es poden alliberar mitjançant el pretractament i la hidròlisi del material lignocel·lulòsic i posteriorment es poden transformar en combustibles com l’etanol. El furfural (FF) i el 5-hidroximetilfurfural (HMF) són furaldehids generats per la deshidratació de sucres durant el pretractament de la lignocel·lulosa i són inhibidors de les soques encarregades de fermentar els sucres. L'estudi de les vies de degradació que condueixen als seus derivats menys tòxics ha obert noves línies d'investigació centrades en la valorització de FF i HMF, donat l’elevat valor dels seus derivats en les biorrefineries. El principal objectiu d'aquesta tesi és contribuir a la valorització biocatalítica del FF i de l’HMF. Inicialment, es va intentar optimitzar l'oxidació enzimàtica d’HMF a 2,5-diformilfurà (DFF) via galactosa oxidasa, catalasa i peroxidasa de rave picant. Es va aconseguir un alt rendiment (>90%) mitjançant l’ajust de la ràtio entre galactosa oxidasa i catalasa i ometent l'addició de peroxidasa. No obstant, es va concloure que el procés tenia algunes limitacions i que l'ús de microorganismes seria un enfoc més factible (i encara no descrit). En la recerca de microorganismes, es va considerar un cribratge de set espècies de Fusarium, que són productors naturals de l'enzim galactosa oxidasa. Cinc de les espècies avaluades van mostrar una alta capacitat per reduir HMF a 2,5-di(hidroximetil)furà (DHMF), i dues d'elles van mostrar capacitat per oxidar HMF a DFF amb baixos rendiments i selectivitats. La producció de DHMF mitjançant microorganismes es va considerar d'interès i es va estudiar utilitzant F. striatum. Va mostrar una elevada tolerància cap al HMF a l'utilitzar mides d'inòcul petites, transformant 75 mM d’HMF en 24 h amb un rendiment i selectivitat alts. L’adició d'HMF per lots va permetre una major concentració de DHMF en el medi. Finalment, es va avaluar la viabilitat de l'escalat de el procés i es va obtenir un elevat rendiment (95%) i selectivitat (98%) en un bioreactor a escala de laboratori (1.3 L), concloent que F. striatum és un candidat prometedor per a la producció de DHMF. Entre les dues espècies de Fusarium que van mostrar oxidació d’HMF a DFF (F. culmorum i F. sambucinum), la primera va mostrar resultats preliminars més prometedors i va ser seleccionada per a l'optimització del procés. Es va trobar que la font de nitrogen i la concentració de glucosa i peptones en el medi van influir en la capacitat de la soca de transformar l'HMF. La concentració de tots dos nutrients es va optimitzar acuradament a través de la Metodologia de Superfície de Resposta mitjançant la construcció de dos Dissenys Centrals Compostos successius. Es va obtenir un alt rendiment (92%) i selectivitat (94%) de DFF en les condicions òptimes a partir de 50 mM d’HMF, descrivint per primera vegada una producció eficient de DFF mitjançant l'ús de microorganismes i obrint una nova línia d'investigació. Finalment, l'últim capítol d'aquesta tesi es va centrar en l'ús de F. striatum com a mètode de desintoxicació biològica en la producció d'etanol a partir d'hidrolitzats lignocel·lulòsics que contenen altes concentracions de FF i HMF. El co-cultiu de F. striatum i una soca de S. cerevisiae que consumeix xilosa va mostrar un millor rendiment que altres mètodes de desintoxicació biològica prèviament reportats en la literatura. A més, va superar els principals inconvenients de la desintoxicació biològica: va degradar concentracions d'inhibidor significativament més altes amb taxes de degradació superiors, la desintoxicació i fermentació es van realitzar simultàniament, hi va haver una desintoxicació completa dels inhibidors i no hi va haver consum de sucres durant el procés de desintoxicació, el que significa que el rendiment d'etanol no es va veure afectat per la presència de F. striatum. Es va obtenir un alt rendiment (0.40 g/g) i productivitat (0.46 g/L/h) d'etanol en un bioreactor a escala de laboratori en presència de 3.5 g/L d’HMF i 2.5 g/l de FF, una concentració de furaldehids que va inhibir la fermentació en absència de F. striatum. A més, els derivats alcohòlics de valor afegit de l'FF i HMF es van produir durant el procés de desintoxicació amb alts rendiments, afegint més valor a l'hidrolitzat lignocel·lulòsic. Els processos biocatalítics desenvolupats en aquesta tesi proporcionen nous mètodes sostenibles per a produir compostos de valor a partir de biomassa i obren noves línies de investigació en la valorització del FF i HMF.

La actual dependencia en los recursos fósiles para producir energía y productos químicos supone una gran preocupación medioambiental. Encontrar alternativas renovables es crucial para sostener la vida futura en el planeta Tierra. La biomasa, específicamente en forma de lignocelulosa, es una alternativa prometedora porque es abundante como residuo, no compite con el suministro alimentario y es la fuente de carbono más copiosa del planeta, conteniendo altas cantidades de azúcares en forma de celulosa y hemicelulosa. Los monosacáridos se pueden liberar mediante el pretratamiento y la hidrólisis del material lignocelulósico y posteriormente se pueden transformar en combustibles como por ejemplo etanol. El furfural (FF) y el 5 hidroximetilfurfural (HMF) son furaldehídos generados por la deshidratación de azúcares durante el pretratamiento de lignocelulosa y son inhibidores de las cepas encargadas de la fermentación. El estudio de las vías de transformación que conducen a sus derivados menos tóxicos ha abierto nuevas líneas de investigación centradas en la valorización de FF y HMF, dado el elevado valor de sus derivados en las biorrefinerías. El principal objetivo de esta tesis es contribuir a la valorización biocatalítica del FF y del HMF. Inicialmente, se intentó optimizar la oxidación enzimática de HMF en 2,5-diformifurano (DFF) vía galactosa oxidasa, catalasa y peroxidasa de rábano picante. Se obtuvo un rendimiento elevado (>90%) mediante el ajuste de la ratio entre galactosa oxidasa y catalasa y omitiendo la adición de peroxidasa. Sin embargo, se concluyó que el proceso tenía algunas limitaciones y que el uso de microorganismos sería un enfoque más factible (y aún no descrito). En la búsqueda de microorganismos, se consideró un cribado de siete especies de Fusarium, que son productoras naturales de la enzima galactosa oxidasa. Cinco de las especies evaluadas mostraron una alta capacidad para reducir HMF en 2,5-di(hidroximetil)furano (DHMF), y dos de ellas mostraron capacidad para oxidar HMF a DFF con bajos rendimientos y selectividades. La producción de DHMF mediante microorganismos se consideró de interés y se estudió utilizando F. striatum. Mostró una elevada tolerancia hacia el HMF al utilizar tamaños de inóculo pequeños, transformando 75 mM de HMF en 24 h con un rendimiento y selectividad altos. La adición de HMF por lotes permitió una mayor concentración de DHMF en el medio. Finalmente, se evaluó la viabilidad del escalado del proceso y se obtuvo un elevado rendimiento (95%) y selectividad (98%) en un biorreactor a escala de laboratorio (1.3 L), concluyendo que F. striatum es un candidato prometedor para la producción de DHMF. Entre las dos especies de Fusarium que mostraron oxidación de HMF a DFF (F. culmorum y F. sambucinum), la primera mostró resultados preliminares más prometedores y fue seleccionada para la optimización del proceso. Se observó que la fuente de nitrógeno y la concentración de glucosa y peptonas en el medio influyeron en la capacidad de la cepa de transformar el HMF. La concentración de ambos nutrientes se optimizó cuidadosamente a través de la Metodología de Superficie de Respuesta mediante la construcción de dos Diseños Centrales Compuestos sucesivos. Se obtuvo un alto rendimiento (92%) y selectividad (94%) de DFF en las condiciones óptimas a partir de 50 mM de HMF, describiendo por primera vez una producción eficiente de DFF mediante el uso de microorganismos y abriendo una nueva línea de investigación. Finalmente, el último capítulo de esta tesis se centró en el uso de F. striatum como método de desintoxicación biológica en la producción de etanol a partir de hidrolizados lignocelulósicos que contienen altas concentraciones de FF y HMF. El co-cultivo de F. striatum y una cepa de S. cerevisiae que consume xilosa mostró un mejor rendimiento que otros métodos de desintoxicación biológica previamente reportados en la literatura. Además, superó los principales inconvenientes de la desintoxicación biológica: degradó concentraciones de inhibidor significativamente más altas con tasas de degradación superiores, la desintoxicación y fermentación se realizaron simultáneamente, hubo una desintoxicación completa de los inhibidores y no hubo consumo de azúcares durante el proceso de desintoxicación, lo que significa que el rendimiento de etanol no se vio afectado por la presencia de F. striatum. Se obtuvo un alto rendimiento (0.40 g/g) y productividad (0.46 g L/h) de etanol en un biorreactor a escala de laboratorio en presencia de 2.5 g/L de FF y 3.5 g/L de HMF, una concentración de furaldehídos que inhibió la fermentación en ausencia de F. striatum. Además, los derivados alcohólicos de valor añadido del FF y HMF se produjeron durante el proceso de desintoxicación con rendimientos elevados, añadiendo más valor al hidrolizado lignocelulósico. Los procesos biocatalíticos desarrollados en esta tesis proporcionan nuevos métodos sostenibles para producir compuestos de valor a partir de biomasa y abren nuevas líneas de investigación en la valorización del FF y HMF.

The current dependence on fossil resources to produce energy and commodity chemicals poses a major concern to the environment. Finding renewable alternatives is crucial to support and sustain future life on planet Earth. Biomass, specifically in the form of lignocellulose, presents as a promising alternative because it is abundant as waste, it does not compete for food supplies, and it is the most copious carbon feedstock of the planet, containing high amounts of sugars in the forms of cellulose and hemicellulose. Monosaccharides can be released through pretreatment and hydrolysis of the lignocellulosic material and further transformed into fuels such as ethanol. Furfural (FF) and 5-hydroxymethylfurfural (HMF) are furaldehydes generated by dehydration of sugars during the pretreatment of lignocellulose and are inhibitors for the sugar fermenting strains. The study of the transformation pathways that lead to their fewer toxic derivatives has opened a new line of research on the upgrade of FF and HMF, given the value of their derivatives at biorefineries. The main objective of this thesis is to contribute to the biocatalytic valorization of FF and HMF. First, an optimization of the enzymatic oxidation of HMF to 2,5-diformylfuran (DFF) via galactose oxidase, catalase, and horseradish peroxidase was attempted. A high yield (>90 %) was achieved by adjusting the ratio between galactose oxidase and catalase and omitting the addition of horseradish peroxidase. However, it was concluded that the process had some limitations and that whole cells would be a more feasible (and yet not described) approach. In the search for whole-cell biocatalysts, a screening of seven Fusarium species, natural producers of the enzyme galactose oxidase, was considered. Five of the species evaluated showed a high capability to reduce HMF to 2,5-di(hydroxymethyl)furan (DHMF), and two of them showed the capability to oxidize HMF to DFF with low yields and selectivities. The whole-cell production of DHMF was considered of interest and studied using F. striatum. It showed high tolerance towards HMF when using small inoculum sizes, transforming 75 mM HMF within 24 h with a high yield and selectivity. A fed-batch approach allowed a higher concentration of DHMF in the media. Finally, the feasibility of the scale-up of the process was evaluated, and a quantitative DHMF yield (95 %) and selectivity (98 %) were obtained in a bench-scale bioreactor (1.3 L), concluding that F. striatum is a promising candidate for DHMF production. Among the two Fusarium species that showed HMF oxidation to DFF (F. culmorum and F. sambucinum), the former showed more encouraging preliminary results and was selected to optimize the process further. It was found that the nitrogen source and the concentration of glucose and peptones in the media highly influenced the redox capability of the strain. The concentration of both nutrients was carefully optimized through Response Surface Methodology by building two successive Central Composite Designs. A high DFF yield (92 %) and selectivity (94 %) were obtained under the optimized conditions starting from 50 mM HMF, thus describing for the first time an efficient whole-cell production of DFF and opening a new line of investigation. Finally, the last Chapter of this thesis was focused on the use of F. striatum as a biological detoxification method in bio-based ethanol production from lignocellulosic hydrolysates containing high concentrations of FF and HMF. A co-culture between F. striatum and a xylose-consuming S. cerevisiae showed better performance than other biological detoxification methods previously reported in the literature. Moreover, it overcame the main drawbacks of biological detoxification: it was able to handle significantly higher inhibitor concentrations with higher degradation rates, the detoxification and fermentation steps were performed simultaneously, there was complete detoxification of the inhibitors, and there was no consumption of sugars during the detoxification process, meaning that the presence of F. striatum did not influence the ethanol yield. A high ethanol yield (0.40 g/g) and productivity (0.46 g/L/h) were obtained in a bench-scale bioreactor in the presence of 2.5 g/L FF and 3.5 g/L HMF, a concentration of furaldehydes that inhibited the fermentation in the absence of F. striatum. Moreover, the added-value alcohol derivatives of FF and HMF were produced during the detoxification process with high yields, adding more value to the lignocellulosic hydrolysate. The biocatalytic approaches developed throughout this thesis provide novel sustainable methods to produce high-value compounds from biomass and open new lines of investigation in the biocatalytic valorization of FF and HMF.