Functional analysis of a phloem cysteine protease in Arabidopsis thaliana

Abstract

Metacaspases are a family of cysteine proteases found in lower eukaryotes and plants. They are considered to be distant relatives of caspases, present only in animals. The role of metacaspases is quite diverse, from developmental processes involved in tissue formation, to responses against pathogens and other environmental stresses. For some members of the family there is ongoing research regarding their function and possible substrates and for some others they have not been characterized. In this study we attempted to functionally analyse Arabidopsis thaliana metacaspase 3 (MC3), an uncharacterized metacaspase which was found to be expressed in the vascular tissue. We considered that the best way to address this challenge was to use a reverse genetics approach in combination with proteomic analysis. In Chapter 2, we specifically identified the exact localization of the transcript and the protein in planta, we generated mutant plants using the CRISPR/Cas9 technology and we analysed their growth in basal conditions. Moreover, we performed a whole proteome analysis for different tissues and we attempted to identify candidate substrates by N-termini analysis. In Chapter 3, we delved into multiple stresses testing how plants with over-accumulation or lack of MC3 responded to stress conditions, since multiple proteins related to stress responses came up from the proteomic study. In Chapter 2 we generated reporter lines to specify the exact localization of the gene expression. MC3 was found specifically expressed in the phloem vascular tissue. Furthermore, translational fusion to fluorescent proteins verified the same pattern for protein localization. Using multiple mutant lines, we performed an analysis of the phenotypes caused from the absence, malfunction or overexpression of the putative protease in the development of the plant. Overall growth and formation of the vascular tissue in particular, were not affected when plants were grown upon standard growth conditions. From previous studies, MC1 reporter lines exhibited expression in the stele in almost every developmental stage and MC4 has a high and ubiquitous expression in most of the tissues.

Double mutants were generated in order to exclude the possibility of functional redundancy and we showed that under normal conditions the overall growth of these plant remained similar to wild-type plants. Finally, we checked the total proteome of the plants to compare the differentially abundant proteins in different expression backgrounds. Overall, the analysis demonstrated that root tissue of MC3 overexpressor lines showed differential accumulation of stress related proteins, specifically osmotic and hypoxic related. Metacaspases have been shown to participate amongst others, in the plant responses to biotic and abiotic stresses. In Chapter 3 we analyzed whether MC3 had a role in responses to different environmental stresses. We found that MC3 function is associated with drought stress, since plants overaccumulating MC3 were able to survive more and performed better under low water availability conditions. Moreover, compared to wild-type plants, mc3 mutant appeared less sensitive to ABA, which is one of the hormones orchestrating drought responses. Considering that the vasculature plays a very important role in facilitating ABA signalling, we investigated vascular formation upon osmotic stress in plants with altered MC3 levels. Overexpressor lines showed a faster formation of the vascular tissue under osmotic stress conditions than wild type plants. Finally, we observed that in conditions of low oxygen concentrations, the excessive amount of MC3 can also be beneficial for plant survival. Additional stresses were tested in order to detect if MC3 function was specific of osmotic unbalances. Plants were not affected of the presence or absence of MC3 upon light and temperature altered conditions, neither upon infection with a vascular pathogen. In conclusion, we reported that metacaspase 3 is a phloem-specific metacaspase which contributes to drought tolerance possibly due to enhanced metaphloem vascular differentiation upon osmotic stress conditions.

Las metacaspasas son una familia de cisteína proteasas que se encuentran en eucariotas inferiores y plantas. Se consideran parientes lejanos de las caspasas, presentes solo en animales. El rol de las metacaspasas es bastante diverso, desde los procesos de desarrollo involucrados en la formación de tejidos, hasta las respuestas contra patógenos y otras tensiones ambientales. Para algunos miembros de la familia se está investigando su función y posibles sustratos y para otros no se han caracterizado. En este estudio intentamos analizar funcionalmente Arabidopsis thaliana metacaspase 3 (MC3), una metacaspasa no caracterizada presente en el tejido vascular. Consideramos que la mejor manera de abordar este desafío era utilizar un enfoque de genética inversa en combinación con el análisis proteómico. En el Capítulo 2, identificamos específicamente la localización exacta de la transcripción y la proteína en planta, generamos plantas mutantes utilizando la tecnología CRISPR / Cas9 y analizamos su crecimiento en condiciones basales. Además, realizamos un análisis de proteoma completo para diferentes tejidos e intentamos identificar sustratos candidatos mediante análisis de péptidos N- terminales. En el Capítulo 3, profundizamos en múltiples estreses mostrando cómo las plantas con sobreacumulación o falta de MC3 respondieron a las condiciones de estrés, ya que del estudio proteómico surgieron múltiples proteínas relacionadas con las respuestas al estrés. En el Capítulo 2 generamos líneas reporteras para especificar la localización exacta de la expresión génica. Se encontró que MC3 se expresaba específicamente en el tejido vascular del floema. Además, la fusión traslacional a proteínas fluorescentes verificó el mismo patrón para la localización de proteínas. Utilizando múltiples líneas mutantes, realizamos un análisis de los fenotipos causados por la ausencia, mal funcionamiento o sobreexpresión de la supuesta proteasa en el desarrollo de la planta. El crecimiento general y la formación del tejido vascular en particular no se vieron afectados cuando las plantas se cultivaron en condiciones de crecimiento estándar. A partir de estudios anteriores, las líneas reporteras de MC1 mostraron expresión en la estela en casi

todas las etapas del desarrollo y MC4 tiene una expresión alta y ubicua en la mayoría de los tejidos. Se generaron mutantes dobles con el fin de excluir la posibilidad de redundancia funcional y mostramos que en condiciones normales el crecimiento general de estas plantas se mantuvo similar al de las plantas de tipo salvaje. Finalmente, comprobamos el proteoma total de las plantas para comparar las proteínas diferencialmente abundantes en diferentes fondos genéticos. En general, el análisis demostró que el tejido de la raíz de las líneas sobreexpresoras de MC3 muestran una acumulación diferencial de proteínas relacionadas con el estrés, específicamente relacionadas con el osmótico y la hipoxia. Se ha demostrado que las metacaspasas participan, entre otras cosas, en las respuestas de las plantas al estrés biótico y abiótico. En el Capítulo 3 analizamos si MC3 tuvo un papel en las respuestas a diferentes tensiones ambientales. Encontramos que la función de MC3 está asociada con el estrés por sequía, ya que las plantas que sobreacumulan MC3 pudieron sobrevivir más y funcionar mejor en condiciones de baja disponibilidad de agua. Además, en comparación con las plantas de tipo salvaje, el mutante mc3 parecía menos sensible a ABA, que es una de las hormonas que orquestan las respuestas a la sequía. Teniendo en cuenta que la vasculatura juega un papel muy importante en la facilitación de la señalización de ABA, investigamos la formación vascular tras el estrés osmótico en plantas con niveles alterados de MC3. Las líneas sobreexpresoras mostraron una formación más rápida del tejido vascular en condiciones de estrés osmótico que las plantas de tipo salvaje. Finalmente, observamos que en condiciones de bajas concentraciones de oxígeno, la cantidad excesiva de MC3 también puede ser beneficiosa para la supervivencia de las plantas. Se probaron tensiones adicionales para detectar si la función de MC3 era específica de los desequilibrios osmóticos. Las plantas no se vieron afectadas por la presencia o ausencia de MC3 por condiciones de luz y temperatura alteradas, ni por infección con un patógeno vascular. En conclusión, reportamos que la metacaspasa 3 es una metacaspasa específica del floema que contribuye a la tolerancia a la sequía posiblemente debido a la diferenciación vascular mejorada del metafloema en condiciones de estrés osmótico.