Estudio de biomarcadores celulares para la implementación de terapias personalizadas en Fibrosis Quística

Abstract

La Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva que ocurre cuando existen variantes patogénicas bialélicas en el gen Cystic Fibrosis Transembrane Regulator (CFTR), y que codifica por una proteína con el mismo nombre. La proteína CFTR se encuentra en las células epiteliales del organismo y funciona, preferentemente, como transportadora de iones Cl- y HCO - . Presenta un papel regulador especialmente importante en los epitelios respiratorio y pancreático, tejidos en dónde se observa una elevada afectación cuando hay disrupción de la función de CFTR. Actualmente, se han descrito alrededor de 2100 variantes identificadas como causantes de la enfermedad y que se clasifican en siete grupos, I-VII, dependiendo del defecto que producen en la proteína CFTR. Un avance importante en el tratamiento de la enfermedad fue el descubrimiento hace pocos años de unas pequeñas moléculas, llamadas moduladoras, capaces de reparar algunos de los defectos iniciales de la proteína CFTR. Varias de estas moléculas han sido aprobadas por las agencias del medicamento estadounidenses y europeas para tratar a pacientes FQ-CFTR que presenten determinados genotipos. Para valorar la funcionalidad de CFTR antes y después del tratamiento con moduladores, es necesaria la realización de ensayos funcionales in vitro en muestras de pacientes. Entre los estudios funcionales, los más destacados se realizan en organoides intestinales, provenientes de epitelio rectal, y en modelos in vitro derivados de células del sistema respiratorio. Para el desarrollo de esta tesis doctoral, se optó por establecer y validar ensayos en células epiteliales nasales y así, poder mimetizar la función CFTR en el sistema respiratorio. Para ello, se optimizó el ensayo funcional en el cultivo de las nasoesferas, estructuras tridimensionales formadas de manera fácil y rápida a partir de epitelio nasal humano. Después de la modificación y mejora del protocolo original del ensayo funcional en nasoesferas, esta metodología muestra la capacidad para representar respuestas del epitelio respiratorio in vitro. También se describen nuevas maneras de analizar las nasoesferas para categorizar mejor las respuestas de CFTR en wild type (WT)-CFTR (n=7) y en FQ-CFTR (n=7). Se describe por primera vez, la correlación, en muestras del mismo paciente, entre los resultados del estudio funcional en nasoesferas con los resultados del ensayo funcional en organoides intestinales (n=3). Para finalizar, se amplió el ensayo funcional en nasoesferas con diez pacientes FQ-CFTR, que presentan variedad de genotipos, con y sin incubación de fármacos moduladores. En esta tesis doctoral, se concluye que el ensayo funcional en nasoesferas puede utilizarse como biomarcador de la funcionalidad de CFTR a nivel respiratorio. Este estudio se puede llevar a cabo como ensayo inicial o herramienta complementaria de otros estudios más complejos e invasivos como los ensayos en organoides intestinales.

Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive disease that occurs when there are biallelic pathogenic variants in the Cystic Fibrosis Transembrane Regulator gene and codifies for a protein with the same name. CFTR protein is located in the epithelial cells and it acts as a Cl- and HCO - transporter. It presents an important regulatory role in the respiratory epithelia and pancreas. Currently, around 2,100 variants have been described and they are grouped into seven classes, depending on the caused CFTR defect. An important advance in the treatment of the disease was the discovery of small molecules, called modulators, capable of repairing some of the initial defects of the CFTR protein. Some of these molecules have been approved as a clinical treatment only for specific CFTR genotypes by the American and European drug agencies. To asses CFTR functionality, before and after modulator treatment, is relevant to perform functional in vitro assays in patient-derived cells. Among the existent functional assays, the most remarkable are the assays using intestinal organoids, from the rectal epithelium, and respiratory cell models. For this thesis, a functional assay using a nasal model was chosen in order to mimic the respiratory CFTR responses. Nasopheroids are three-dimensional structures easily and rapidly formed from nasal epithelial human cells and, during this thesis, it has been demonstrated its capacity to represent respiratory in vitro responses. The description of new ways to analyze nasospheroids are also described to better categorize CFTR responses in wild type (WT)-CFTR (n = 7) and FQ-CFTR (n = 7) groups. For the first time, the correlation between the results of the functional assay in the nasospheroids with those obtained in intestinal organoids from the same individuals (n=3) was described. Finally, the functional assay in nasosheporids was expanded with ten CF patients, presenting a variety of genotypes, with and without modulators. In the present doctoral thesis, it is concluded that the functional assay in nasospheroids can be used as a biomarker of CFTR functionality at the respiratory level. This study can be carried out as an initial test or a complementary tool for other studies.