Bioprocess Engineering for HIV-1 Gag VLP Production in HEK293 Cells

Abstract

La importància de les noves tecnologies de producció de vacunes s’ha convertit recentment en un assumpte de gran rellevància a causa de l’aparició de la pandèmia COVID-19. No obstant això, el desenvolupament de les tecnologies de producció de vacunes com a mesura per a combatre les malalties infeccioses mai ha cessat. La recerca en el camp de les tecnologies de producció de vacunes està altament relacionada amb la recerca en enginyeria de bioprocessos. Aquesta tesi doctoral se centra en l’estudi del bioprocés per a produir partícules semblants a virus (VLPs) del virus de la immunodeficiència humana (VIH) basades en la poliproteïna Gag del mateix virus, usant cèl·lules HEK293 i transfecció transitòria com a plataforma productora. Aquestes VLPs són nanoestructures no infeccioses envoltades de membrana cel·lular la conformació de la qual s’assembla a la del virus natiu del VIH, però sense el seu material genètic. Posteriorment, la membrana que les envolta es pot modificar, afegint antígens d’altres malalties per a estimular el sistema immune i usar-les com a potencials vacunes. Per a poder optimitzar la producció de VLPs, és necessari l’estudi de múltiples factors, que van des de rutes metabòliques a nivell cel·lular fins al disseny de les condicions i paràmetres d’operació a escala de bioreactor. En el treball que es presenta en aquesta tesi doctoral, aquest repte pot dividir-se en tres parts principals. La primera part, presentada en els Capítols ú i dos, se centra en l’optimització del procés de producció de VLPs a nivell cel·lular, mitjançant proteòmica i enginyeria metabòlica. Aquí, els efectes de la transfecció transitòria i la producció de VLPs ha estat estudiada a nivell molecular usant proteòmica quantitativa per a identificar colls d’ampolla en el metabolisme influenciant la producció de VLPs. Una vegada identificats, s’han aplicat estratègies d’enginyeria metabòlica usant disseny d’experiments (DoE) per a optimitzar la transfecció i el procés de generació de partícules. La segona part, presentada en el Capítol tres, se centra en la intensificació i optimització de la producció de VLPs a nivell de bioreactor, establint un procés en perfusió. Per a això s’ha estudiat el medi de cultiu, els agents per a formar els complexos de DNA i les condicions de cultiu en el bioreactor. A més, usant estratègies com el DoE s’han optimitzat paràmetres operacionals com el recanvi específic de medi per cèl·lula (CSPR), la quantitat de DNA usada per a transfectar i els temps de retransfecció. Així mateix, s’han provat diferents equips de retenció cel·lular per a arribar a implementar un sistema de perfusió en continu. La tercera i última part, que comprèn els Capítols quatre, cinc i sis, se centra en la caracterització del producte, dirigida a dissenyar un procés de purificació eficient. Per a establir un mètode analític que determini l’estequiometria de la proteïna Gag en les VLPs produïdes en diferents tipus cel·lulars, s’ha usat la tècnica parallel reaction monitoring (PRM), contribuint a la millora de futurs mètodes de control de qualitat i analítics (PAT) per a un futur bioprocés a gran escala. A més, la vesícules extracelul·lars (EVs) que es coprodueixen amb les VLPs han estat estudiades mitjançant proteòmica quantitativa per a entendre la seva naturalesa ja que són les principals impureses de les preparacions de VLPs. D’igual forma s’ha caracteritzat el perfil de glicosilacions de les VLPs i les EVs per a ampliar el coneixement que i permetre dissenyar un procés de purificació específic per a VLPs. Els resultats que aquí es presenten contribueixen al desenvolupament d’una prometedora plataforma per a la producció de vacunes basades en VLPs de Gag i aplanen el camí per a l’avanç i l’evolució del camp de la producció de vacunes.

La importancia de las nuevas tecnologías de producción de vacunas se ha convertido en un asunto de gran interés recientemente debido a la aparición de la pandemia COVID-19. Sin embargo, el desarrollo de las tecnologías de producción de vacunas contra la afección de enfermedades infecciosas a lo largo de la historia nunca ha cesado. La investigación en el campo de las tecnologías de producción de vacunas está altamente relacionada con la investigación en el desarrollo de bioprocesos. Esta tesis doctoral se centra en el estudio del bioproceso para producir partículas semejantes a virus (VLPs) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) basadas en la poliproteína Gag del mismo virus, usando células HEK293 y transfección transitoria. Estas VLPs son nanoestructuras no infecciosas rodeadas de membrana celular cuya conformación se asemeja a la del virus nativo del VIH, pero sin su material genético. Posteriormente, la membrana que las rodea se puede modificar, añadiendo antígenos de otras enfermedades para estimular el sistema inmune y usarlas como potenciales vacunas. Para poder optimizar la producción de VLPs, es necesario el estudio de múltiples factores, que van desde rutas metabólicas a nivel celular hasta el diseño de las condiciones y parámetros de operación a escala de biorreactor. En el trabajo que se presenta en esta tesis doctoral, este reto puede dividirse en tres partes principales. La primera parte, presentada en los capítulos uno y dos, se centra en la optimización del proceso de producción de VLPs a nivel celular, mediante proteómica e ingeniería metabólica. Aquí, se han estudiado los efectos de la transfección transitoria y la producción de VLPs a nivel molecular usando proteómica cuantitativa para identificar cuellos de botella en el metabolismo influenciando la producción de VLPs. Una vez identificados, se han aplicado estrategias de ingeniería metabólica usando diseño de experimentos (DoE) para optimizar la transfección y el proceso de generación de partículas. La segunda parte, presentada en el capítulo tres, se centra en la intensificación y optimización de la producción de VLPs a nivel de biorreactor, para establecer un proceso en perfusión. Para ello se ha estudiado el medio de cultivo, los reactivos para formar los complejos de DNA y las condiciones de cultivo en el biorreactor. Además, usando estrategias como el DoE se han optimizado parámetros operacionales como el recambio específico de medio (CSPR), la cantidad de DNA usada para transfectar y los tiempos de retransfección. Asimismo, se han probado diferentes equipos de retención celular para llegar a implementar un sistema de perfusión en continuo. La tercera y última parte, que comprende los capítulos cuatro, cinco y seis, se centra en la caracterización del producto, dirigida a diseñar un procesos de purificación eficiente. Para establecer un método analítico que determine la estequiometría de la proteína Gag en las VLPs producidas en distintos tipos celulares, se ha usado la técnica parallel reaction monitoring (PRM), contribuyendo a la mejora de futuros métodos de control de calidad y analíticos (PAT) en un futuro bioproceso a gran escala. Además, la vesículas extracelulares (EVs) que se coproducen con las VLPs han sido estudiadas mediante proteómica cuantitativa para entender la naturaleza de las que son las principales impurezas de las preparaciones de VLPs. De igual forma se ha caracterizado el perfil de glicosilaciones de las VLPs y las EVs para ampliar el conocimiento que ayude a diseñar un proceso de purificación específico para VLPs. Los resultados que aquí se presentan contribuyen al desarrollo de una prometedora plataforma para la producción de vacunas basadas en VLPs de Gag y allanan el camino para el avance y la evolución del campo de la producción de vacunas.

The importance of vaccine technology has recently become a matter of high interest due to the outbreak of the COVID-19 pandemic. However, the development of vaccine technology against infectious diseases throughout history has never stopped. It has influenced the way the population interacts and the establishment of social rules. The research in the field of vaccine technology is deeply tied to the research in bioprocess engineering, as in a globalized world, an effective vaccine is the one that can be produced at large scale, reaching as many people as possible through efficient vaccination policies. This PhD thesis is focused on the study of the bioprocess for the production of human immunodeficiency virus (HIV-1) virus- like particles (VLPs) based on the HIV-1 polyprotein Gag using HEK293 cells and transient transfection. These VLPs are non-infectious membrane-bound nanostructures whose conformation resembles the native HIV-1 virus albeit lacking the viral genetic material. In order to use these particles as potential vaccines, they can be later modified presenting exogenous antigens in their membrane to elicit an immune response against different diseases. In order to optimize VLP production, multiple aspects of the bioprocess must be studied, from molecular factors like cellular pathways to the modulation of operational parameters at bioreactor scale. In this work, this undertaken challenge can be divided in three main parts. The first part, comprising chapters one and two, focused on the optimization of the VLP production process at cellular level through proteomics and metabolic engineering. Here, the effects of transient transfection and production of VLPs was studied at molecular level using multiplexed quantitative proteomics to identify metabolic bottlenecks influencing VLP production. Once these pathways were identified, metabolic engineering and design of experiments (DoE) approaches were applied to optimize transfection, cell budding efficiency and VLP production. The second part, comprising chapter three, focused on the intensification and optimization of VLP production at bioreactor level, implementing a perfusion-based bioprocess. The culture media used, the DNA complexation agent and culture conditions in the bioreactor were studied. Also, operational parameters like the cell specific perfusion rate (CSPR), the amount of DNA used for transfection and the time of retransfection were also optimized using a DoE approach. Moreover, different cell retention devices were tested to work towards the implementation of a continuous harvest mode of operation. The third and last part, comprising chapters four, five and six, focused on the characterization of the product aiming to design an efficient downstream process. Parallel reaction monitoring (PRM) was used to establish a method of determining Gag stoichiometry in the VLPs for different production platforms, paving the way for improvements in quality control and process analytics technologies (PAT) in a future large scale bioprocess. Moreover, the coproduced extracellular vesicles (EVs) were studied through multiplexed quantitative proteomics to better understand the nature of the main source of impurities in a VLP preparation. Additionally, EV and VLP glycosylations were analyzed, to characterize the two nanostructures glycosylation signature and help gain some insight towards the design of a specific separation method for VLP purification. The results hereby presented contribute to the development of a promising vaccine platform based on Gag VLPs and pave the way towards the advance and evolution of vaccine manufacturing.