Caracterització dels mecanismes neuromotors i neurosecretors en el còlon de porc. Canvis associats a la infecció per E. coli i a la socialització durant la lactació

Abstract

En aquest treball hem caracteritzat els mecanismes neuromusculars i neurosecretors i la funció barrera del còlon distal del porc. A més a més, hem valorat aquests mecanismes en dos models animals representatius del cicle productiu porcí, un model d’infecció experimental per l’Escherichia coli enterotoxigènic (ETEC) i un model de socialització primerenca i d’enriquiment ambiental durant la lactació. En els dos models utilitzats, vam observar la presència d’un to neural inhibitori basal que es va poder bloquejar amb l’addició de L-NNA (inhibidor competitiu de l’òxid nítric sintasa, NOS) i de MRS2500 (antagonista ortostèric del receptor P2Y1). Per caracteritzar la resposta inhibitòria vam comparar el MRS2500 amb el BPTU, un antagonista al·lostèric del receptor P2Y1, que podria guanyar selectivitat en la resposta comparat amb el MRS2500. En el nostre estudi, el BPTU va mostrar una recuperació parcial de la resposta inhibitòria induïda per estímul de camp i per l’agonista P2Y, ADPβS, tot i que, la reversió total només es va assolir amb l’addició de MRS2500. Per caracteritzar la neurotransmissió excitatòria, vam utilitzat unes condicions “no-nitrèrgiques, no purinèrgiques” (incubació amb L-NNA i MRS2500) per estimular, de manera selectiva, les neurones excitatòries colinèrgiques. La caracterització de la resposta neurosecretora mitjançant l’estimulació elèctrica de camp va demostrar que els principals neurotransmissors implicats en la resposta secretora són l’acetilcolina i el pèptid intestinal vasoactiu. A més a més, diferents mediadors, com són el carbacol, el pèptid intestinal vasoactiu, la serotonina, la nicotina, el forskolin i la histamina van estimular la secreció epitelial de clor. Pel que fa al model d’infecció experimental per ETEC, vam observar que els animals presentaven una alteració de la funció barrera (dia 4 post-infecció), un increment del transport actiu electrogènic (dia 4 i 9 post-infecció), així com un increment del nombre de mastòcits de la mucosa (dia 9 post-infecció). Aquests canvis, van ser probablement deguts a l’estimulació del sistema nerviós entèric i del sistema immune per part de les toxines alliberades per l’ETEC i a un efecte epitelial. En canvi, els mecanismes neuromusculars es van mantenir inalterats. En el model de socialització primerenca i d’enriquiment ambiental, vam observar que els animals enriquits presentaven una disminució del transport actiu electrogènic (a dia 3 post-deslletament), probablement degut a que el tractament etiològic i l’enriquiment ambiental van proporcionar una millor adaptació a la situació d’estrès originada pel deslletament. En canvi, els mecanismes neuromusculars es van mantenir inalterats. En aquest treball, per tant, hem explorat noves eines farmacològiques que ens han permès caracteritzar, de manera adequada, els mecanismes neurals que porten a la contracció i relaxació muscular i a la secreció epitelial. No hem observat canvis motors en cap dels dos models estudiats. En canvi, la infecció per ETEC va incrementar de manera transitòria la permeabilitat de la barrera i va activar un mecanisme neurosecretor que és en part responsable de la diarrea. En el model de socialització vam observar una disminució del transport actiu electrogènic que podria ser interpretada com una millor adaptació dels animals al deslletament.

En el presente trabajo hemos caracterizado los mecanismos neuromusculares y neurosecretores y la función barrera en el colon del cerdo. Además, hemos valorado estos mecanismos en dos modelos animales representativos del ciclo productivo porcino, un modelo de infección experimental por Escherichia coli enterotoxigénico (ETEC) y un modelo de socialización temprana y de enriquecimiento ambiental durante la lactación. En los dos modelos utilizados, observamos la presencia de un tono neural inhibitorio basal que se bloqueó con la adición de L-NNA (inhibidor competitivo del óxido nítrico sintasa, NOS) y de MRS2500 (antagonista ortostérico del receptor P2Y1). Para caracterizar la respuesta inhibitoria, comparamos el MRS2500 con el BPTU, un antagonista alostérico del receptor P2Y1, que podría ganar selectividad en la respuesta comparado con el MRS2500. Nuestro estudio mostró que el BPTU produce una recuperación parcial de la respuesta inhibitoria inducida por estímulo de campo y por el agonista P2Y1, ADPβS, aún que, la reversión total solo se obtuvo con la adición de MRS2500. Para caracterizar la neurotransmisión excitatoria, utilizamos unas condiciones “no-nitrérgicas, no purinérgicas” (incubación con L-NNA y MRS2500) para estimular, selectivamente, las neuronas excitatorias colinérgicas. La caracterización de la respuesta neurosecretora mediante la estimulación eléctrica de campo demostró que los principales neurotransmisores implicados en la respuesta secretora son la acetilcolina y el péptido intestinal vasoactivo. Además, diferentes mediadores, como el carbacol, el péptido intestinal vasoactivo, la serotonina, la nicotina, el forskolin i la histamina, estimularon la secreción epitelial de cloro. El modelo de infección experimental por ETEC, produjo una alteración de la función barrera (día 4 post-infección), un incremento del transporte activo electrogénico (día 4 y 9 post-infección), así como un incremento del nombre de mastocitos de mucosa (día 9 post-infección). Estos cambios, fueron posiblemente debidos a la estimulación del sistema nervioso entérico y del sistema immune por parte de las toxinas liberadas por el ETEC y a un efecto epitelial. En cambio, los mecanismos neuromusculares se mantuvieron inalterados. En el modelo de socialización temprana y de enriquecimiento ambiental durante la lactación, observamos que los animales enriquecidos presentaban una disminución del transporte activo electrogénico (a día 3 post-destete), probablemente debido a que el tratamiento etológico y el enriquecimiento ambiental proporcionaron una mejor adaptación a la situación de estrés originada por el destete. En cambio, los mecanismos neuromusculares se mantuvieron inalterados. En este trabajo, por lo tanto, hemos explorado nuevas herramientas farmacológicas que nos han permitido caracterizar los mecanismos neurales que producen la contracción y relajación musculares y la secreción epitelial. No hemos observado cambios motores en ninguno de los dos modelos estudiados. En cambio, la infección por ETEC incrementó, de forma transitoria, la permeabilidad de la barrera y activó un mecanismo neurosecretor que es, en parte, responsable de la diarrea. En el modelo de socialización temprana observamos una disminución del transporte activo electrogénico que podría ser interpretado como una mejor adaptación de los animales al destete.

In this work, we have characterized the neuromuscular and neurosecretory mechanisms and the barrier function of the pig colon in two animal models representative of the productive porcine cycle, namely, an experimental model of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) infection and a model of early socialization and environmental enrichment during lactation. In both animal models, we observed an inhibitory neural tone that was sensitive to L-NNA (a competitive inhibitor of the nitric oxide synthase, NOS) and MRS2500 (an orthosteric antagonist of the P2Y1 receptor). To characterize the inhibitory neuromuscular transmission, we compared MRS2500 with BPTU, which is an allosteric antagonist of the P2Y1 receptor that could develop a more selective response compared with the MRS2500. In our work, BPTU produced a partial reversion of the inhibitory response induced by electrical field stimulation and the P2Y agonist, ADPβS, although the complete blockade of the response was only achieved with the addition of MRS2500. To characterize the excitatory neuromuscular transmission, we used non-nitrergic non-purinergic conditions (incubation of L-NNA and MRS2500) to selectively stimulate the cholinergic excitatory neurons. The neurosecretory response was characterized by electrical field stimulation. We observed that the two major neurotransmitters involved in the secretory response were acetylcholine and vasoactive intestinal peptide. In addition, different mediators, such as carbachol, vasoactive intestinal peptide, serotonin, nicotine, forskolin and histamine stimulated epithelial secretion of chloride. Regarding the experimental infection model with ETEC, we observed that animals showed an intestinal barrier dysfunction (day 4 post-infection), an increase in the active electrogenic transport (day 4 and 9 post-infection), as well as an increase of the number of mucosal mast cells (day 9 post-infection). These alterations were probably due to the stimulation of the immune and the enteric nervous systems by the enterotoxins released by the ETEC. In contrast, the neuromuscular mechanisms remained unchanged. In the early socialization and environmental enrichment model during lactation, we observed that enriched animals showed a decrease in active electrogenic transport (at day 3 post-weaning). This observation was probably due to the etiological treatment and the environmental enrichment that provided a better adaptation to the stress situation caused by weaning as compared with the control animals. In contrast, the neuromuscular mechanisms remained unchanged. In this work, we have therefore explored new pharmacological tools that have allowed us to adequately characterize the neural mechanisms that lead to muscle contraction and relaxation and epithelial secretion. We did not observe motor changes in either of the two models studied. In contrast, ETEC infection transiently increased the colonic permeability and activated a neurosecretory mechanism that could be partly responsible for diarrhoea. In the socialization model, we observed a decrease in electrogenic active transport that could be a result of a better adaptation of the animals to weaning.