Actividad antineoplásica de nanotoxinas dirigidas a células CXCR4+ en un nuevo modelo murino de cáncer de endometrio avanzado

Abstract

El càncer d’endometri (CE) és el més freqüent dels tumors infiltrants del tracte genital femení, i el tercer càncer més prevalent entre les dones europees. La supervivència a cinc anys és del 56% quan hi ha metàstasis regionals, i del 20% quan són distals. Cal desenvolupar noves estratègies terapèutiques que puguin millorar el tractament actual aconseguint una major inhibició de la disseminació metastàtica, així com una reducció significativa de la seva toxicitat sistèmica associada a efectes adversos. En col·laboració amb el grup de Nanobiotecnologia de la Universitat Autònoma de Barcelona, el nostre grup ha desenvolupat nanopartícules proteiques autoensamblables, basades en el disseny i la estructura T22-GFP-H6, dirigides específicament a cèl·lules que expressen el receptor de quimiocines CXCR4 (cèl·lules CXCR4+). Aquest receptor està sobreexpressat, en el teixit tumoral en CE. El seu anàlisis per immunohistoquímica de biòpsies tumorals d’una cohort de 79 pacients afectades per CE, va demostrar la seva sobreexpressió en més del 90% de les pacients, presentant un patró d’expressió en membrana. Això suggereix que es tracta d’una bona diana terapèutica també en aquest tipus tumoral, fent-lo susceptible d’esser tractat amb nanopartícules terapèutiques dirigides a cèl·lules tumorals CXCR4+. Per l’avaluació preclínica de les nostres nanopartícules, vam generar noves línies cel·lulars de CE amb sobreexpressió de CXCR4 i luciferasa. D’entre les línies que vam transduir, vam seleccionar la línia AN3CA CXCR4+ pel desenvolupament de models xenògrafs d’implantació subcutània i ortotòpica. Amb aquest últim vam aconseguir imitar les característiques clinicopatològiques del CE en estadis avançats, amb una tassa d’implantació de tumor primari i desenvolupament de metàstasis distals del 100% dels animals. A més, vam demostrar que la sobreexpressió de CXCR4 va exercir un gran efecte respecte a l’augment de la disseminació metastàtica. El nanoportador T22-GFP-H6 va demostrar una gran eficiència d’internalització depenent de CXCR4 sense citotoxicitat in vitro. En el model subcutani, va ser captat principalment pel teixit tumoral, CXCR4+, amb un pic de fluorescència a les 5 hores després de l’administració, sense alteracions histopatològiques en òrgans no tumorals. Després del cribratge amb diverses nanopartícules terapéutiques, vam observar que les basades en toxines bacterianes, T22-DITOX-H6 i T22-PE24-H6, exercien in vitro, a la línia AN3CA CXCR4+, un major efecte citotòxic, que era depenent de CXCR4 i estava mediat per inducció d’apoptosi. Aquesta via de mort cel·lular va ser confirmada in vivo desprès de l’administració de les nanotoxines en el model subcutani CXCR4+. També vam demostrar que ambdues, quan s’administraven a dosis repetides en el model subcutani, inhibien el creixement tumoral i augmentaven la supervivència dels ratolins en absència de toxicitat sistèmica associada. Per últim, l’administració repetida de T22-DITOX-H6, la nanotoxina que va demostrar un efecte antitumoral més potent, en el model ortotòpic CXCR4+ va inhibir el desenvolupament de metàstasis peritoneals, limfàtiques, hepàtiques i pulmonars, disminuint dràsticament tant el nombre com l’àrea dels focs metastàtics en fetge, així com l’àrea de teixit envaït al pulmó. Aquest potent efecte antimetastàtic va tenir lloc a dosis baixes (5 µg q3d x 14 dosis) i en absència de toxicitat sistèmica. La nostra nanopartícula T22-DITOX-H6 presenta múltiples avantatges respecte d’altres teràpies oncològiques pel que fa al seu direccionament actiu a cèl·lules CXCR4+, la seva mida nanomètrica i la seva naturalesa proteica, així com el seu singular mecanisme d’acció que inhibeix la síntesi de proteïnes. Aquestes propietats contribueixen a aconseguir un gran efecte antineoplàstic sense toxicitat inespecífica, com hem demostrat en els models animals CXCR4+ que hem generat en aquesta tesi. Creiem que aquesta nanopartícula pot ser una excel·lent alternativa terapèutica, i promet contribuir a solucionar la manca de tractament efectiu per a les pacients de CE CXCR4+ avançat, recurrent o amb alt risc de recaiguda.

El cáncer de endometrio (CE) es el más frecuente de los tumores infiltrantes del tracto genital femenino, y el tercer cáncer más prevalente entre las mujeres europeas. La supervivencia a cinco años es del 56% si existen metástasis regionales, y de solo el 20% si las metástasis son distales. Es necesario desarrollar nuevas estrategias terapéuticas que mejoren el tratamiento actual para conseguir una mayor inhibición de la diseminación metastática, así como una reducción significativa de su toxicidad sistémica asociada. En colaboración con el grupo de Nanobiotecnología de la Universidad Autónoma de Barcelona, nuestro grupo ha desarrollado nanopartículas proteicas autoensamblables, basadas en el diseño y la estructura T22-GFP-H6, dirigidas específicamente a células con expresión del receptor de quimiocinas CXCR4 (células CXCR4+). Este receptor está sobreexpresado en tejido tumoral de CE. El análisis por inmunohistoquímica de biopsias tumorales de una cohorte de 79 pacientes afectadas de CE demostró sobreexpresión de CXCR4 en más del 90% de los casos, con un patrón predominantemente membranal. Esto sugiere que podría ser una buena diana terapéutica en este tipo tumoral, siendo susceptible de ser tratado con nanopartículas terapéuticas dirigidas a células tumorales CXCR4+. Para la evaluación preclínica de las nanopartículas, generamos nuevas líneas de CE con sobreexpresión de CXCR4 y de luciferasa. De entre ellas, seleccionamos la línea AN3CA CXCR4+ para el desarrollo de modelos xenógrafos de implantación subcutánea, en ratones Swiss nude, y ortotópica, en NSG. Este último modelo replicó las características clinicopatológicas del CE en estadios avanzados, con una tasa de implantación de tumor primario y desarrollo de metástasis distales en el 100% de los animales. También demostramos que la sobreexpresión de CXCR4 ejerció un gran efecto en el aumento de la diseminación metastática. El nanotransportador T22-GFP-H6 demostró una gran eficiencia de internalización y dependencia de CXCR4 en ausencia de citotoxicidad in vitro. En el modelo subcutáneo, se biodistribuyó principalmente en el tejido tumoral, CXCR4+, con un pico de fluorescencia a las 5 horas tras la administración, sin observarse acumulación o alteraciones histopatológicas en órganos no tumorales. Por otro lado, tras un cribaje de diversas nanopartículas portadoras de distintos agentes terapéuticos, observamos que las que incorporaban toxinas bacterianas, T22-DITOX-H6 y T22-PE24-H6, ejercían en la línea AN3CA CXCR4+ un gran efecto citotóxico, dependiente de CXCR4 y mediado por inducción de apoptosis. Esta vía de muerte celular fue confirmada en el modelo subcutáneo CXCR4+ tras la administración de las nanotoxinas. También demostramos que ambas, administradas a dosis repetidas en el modelo subcutáneo, inhibían el crecimiento tumoral, aumentando la supervivencia de los ratones, en ausencia de toxicidad sistémica y de acumulación en órganos no tumorales. Por último, T22-DITOX-H6, con mayor efecto antitumoral en el modelo subcutáneo, fue administrada a dosis repetidas también en el modelo ortotópico CXCR4+, demostrando inhibir el desarrollo de metástasis peritoneales, linfáticas y hematógenas. Disminuyó drásticamente tanto el número como el área de los focos metastáticos en hígado, así como el porcentaje de pulmón invadido por células tumorales. Este potente efecto antimetastático tuvo lugar a una dosificación baja y en ausencia de toxicidad sistémica. Nuestra nanopartícula T22-DITOX-H6 muestra múltiples ventajas respecto a otras terapias oncológicas, en cuanto a su direccionamiento activo a células CXCR4+, su tamaño nanométrico, y su naturaleza proteica, así como su singular mecanismo de acción. Todo ello conlleva un elevado efecto antineoplásico en ausencia de toxicidad sistémica. Creemos que esta nanopartícula puede ser un excelente abordaje terapéutico,tras el pertinente desarrollo preclínico, contribuyendo a solucionar la falta de tratamiento efectivo para las pacientes de CE CXCR4+ avanzado, recurrente o con alto riesgo de recaída.

Endometrial cancer (EC) is the most common cancer in the female genital tract, and the third leading cancer in European women. Its five-year survival is of a 56% or 20% when locoregional or distal metastasis occur, respectively. Thus, there’s an unmet medical need calling for developing new therapeutic approaches that improve current treatment by achieving a higher inhibition of metastatic dissemination, as well as a significant reduction of its associated systemic toxicity. In collaboration with the Nanobiotechnology group at Universitat Autònoma de Barcelona, our group has developed self-assembling protein nanoparticles, based on T22-GFP-H6 design and structure, to specifically target cells which express chemokine receptor CXCR4 (CXCR4+ cells). This receptor is overexpressed in EC tumor tissue. Immunohistochemical analysis of tumor biopsies from 79 EC patients showed its overexpression in more than 90% of the cases, with predominantly membrane localization. This suggests CXCR4 could be a good therapeutic target in this tumor type, which could be treated using therapeutic nanoparticles targeted to CXCR4+ cells. For the preclinical development of our nanoparticles, we generated new CXCR4+ EC cell lines, which also overexpressed luciferase to allow cell tracking. Among them, we selected the CXCR4+ AN3CA cell line to develop xenograft models of subcutaneous and orthotopic implantation, in Swiss nude or NSG mice, respectively. Our orthotopic models mimicked the clinicopathological features of EC in advanced stages, having a rate of tumor implantation and metastasis development of 100%. Moreover, CXCR4 overexpression showed a large effect on metastatic dissemination. Our nanocarrier, T22-GFP-H6, showed a high and CXCR4-dependent internalization, especially in the AN3CA cell line, without associated cytotoxicity. Moreover, in our subcutaneous model, it was mainly uptaken by CXCR4+ cells in the tumor, reaching its peak after 5 hours from administration. Non-tumor organs showed no histopathological alterations or nanoparticle accumulation. Besides, a screening of multiple nanoparticles carrying different therapeutic agents identified those incorporating bacterial toxins, T22-DITOX-H6 and T22-PE24-H6, as the ones exerting a higher cytotoxic effect in CXCR4+ AN3CA cell line. This effect was CXCR4-dependent and mediated by apoptosis induction, a cell death mechanism that was also confirmed in our subcutaneous model after the intravenous administration of the nanotoxins. In addition, the repeated administration of both nanotoxins in the same model, achieved inhibition of tumor growth, leading to increased mice survival in the absence of side toxicity or nanoparticle accumulation in non-tumor organs. Finally, we used T22-DITOX-H6, which showed the highest antitumor effect, on a repeated dose schedule, to assess its antimetastatic effect on our orthotopic CXCR4+ model. This nanotoxin inhibited the development of peritoneal, lymph node, liver and lung metastasis. Regarding hematogenous metastasis, it dramatically reduced both the number and the area of metastatic foci in liver, as well as the percentage of the area occupied by metastatic cells in the lung. This powerful antitumor effect was exerted at a low dosage, without systemic toxicity. To sum up, our nanoparticle T22-DITOX-H6 shows many advantages over other oncological therapies, including its active targeting to CXCR4+ cells, its nanometric size, and its proteic nature, as well as its unique mechanism of action, inhibiting protein synthesis. All of these nanoparticle properties lead to a high antineoplastic effect in the absence of systemic toxicity. We believe this nanoparticle could represent an excellent therapeutic approach for CXCR4+ EC patients with an advance stage, high risk of progression or recurrent tumors, once after its appropriate preclinical development, since no effective treatments are currently available.