Advances in NMR spectroscopic methodology and applications: time-efficient methods, ultra long-range heteronuclear correlation experiments and enantiospecific analysis of complex mixtures

Abstract

Aquesta tesi presentada per compendi d’articles i titulada “Desenvolupament de nous mètodes d’espectroscòpia de RMN per a la reducció del temps experimental, la mesura de correlacions heteronuclears a llarga distància i la diferenciació d’enantiòmers en mescles complexes”, es divideix fonamentalment en tres blocs: i) el desenvolupament d’experiments de Ressonància Magnètica Nuclear (RMN) enfocats a l’eficiència en termes de temps, ii) establir noves seqüències de pols que facilitin l’estudi de constants d’acoblament a llarga distància fonamentals per a l’elucidació estructural, i iii) el desenvolupament d’un mètode fiable que permeti l’anàlisi diferenciat d’enantiòmers (enantioespecific) directament a la mescla de la qual forma part originàriament (in situ) i de múltiples molècules simultàniament (multicomponent). Els experiments de RMN desenvolupats usant l’enfocament de MFA (Multiple Fid Acquisition) basat en el “afterglow magnetization”, permet una considerable disminució del temps experimental mitjançant l’adquisició de diversos experiments alhora, que són emmagatzemats en diferents FIDS i es poden visualitzar per separat. En aquesta tesi es presenten diversos treballs que permeten fer una elucidació estructural de molècules orgàniques d’una forma ràpida, senzilla i sense ambigüitats entre ells, com són MFA-COSY / RELAY3, MFA-COSY / TOCSY, MFA-HMBC / HMBC-COSY, MFA-MBOB -COSY, MFA-TOCSY / TOCSY, MFA-HSQC / HSQC i el MFA-HSQC / Pure-shiftHSQC. A més, amb una adequada combinació de MFA i “Spectral Aliasing” (SA), es presenta un nou experiment, que a més del temps experimental, millora la resolució espectral i facilita la identificació estructural. El SA, tot i ser un poderós experiment per evitar solapament dels senyals té una important desavantatge relacionada amb la identificació de cada senyal, per evitar aquest problema, per uns segons extra, vam adquirir els dos experiments heteronuclears en 2D, el HSQC amb “Spectral Aliasing”i el HSQC estàndard per facilitar l’assignació de senyals. A més, en termes de millora de la resolució espectral, en aquesta tesi es presenten dos experiments essencialment seguint la metodologia de Pure-shift per eliminar la constant d’acoblament protó-protó, usant BIRD (BIlinear Rotation Decoupling) per a realitzar el desacoblament heteronuclear, minimitzant el solapament de senyals. La novetat d’aquest treball es basa en la detecció de múltiples nuclis en el mateix espectre de 2D, nitrogen i carboni en la dimensió indirecta (F1) i protó en F2, és el que es coneix com “Time-Shared NMR experiments”. A més, usant el mateix enfocament, es presenta un segon experiment que permet el càlcul (via observació directa) de les constants heteronuclears d’acoblament protó-carboni i protó-nitrogen simultàniament. Un important repte a l’espectroscòpia de RMN és la mesura de constants d’acoblament heteronuclear a llarga distància, ja que són valors molt petits, i per tant, són difícils de mesurar. Una modificació en l’experiment LR-HSQMBC (canviant uns polsos de 180 º per polsos selectius irradiats en una zona del espectre), va permetre la mesura de constants d’acoblament molt petites (de fins a 6 enllaços de separació). En aquest treball s’exposen els avantatges d’aquest nou LR-selHSQMBC experiment de RMN i, a més, es comparen explicant els avantatges i desavantatges d’ambdós experiments. Finalment, en aquesta tesi es presenta un treball innovador relacionat amb la detecció enantioespecífica i simultània de múltiples parells d’enantiòmers en una mescla sense prèvia separació ni derivatització dels seus components i amb una mínima manipulació de la mostra. Aquest mètode es basa en espectroscopia de RMN i es fonamenta en l’ús d’un auxiliar quiral tipus agent de solvatació quiral (CSA). En aquest treball es mostra com a prova de concepte la enantiodifferenciació simultània per RMN de múltiples parelles d’enantiòmers directament a la seva matriu original.

Esta tesis presentada por compendio de artículos y titulada “Desarrollo de nuevos métodos de espectroscopía de RMN para la reducción del tiempo experimental, la medida de correlaciones heteronucleares a larga distancia y la diferenciación de enantiómeros en mezclas complejas”, se divide fundamentalmente en: i) el desarrollo de experimentos de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) enfocados a la eficiencia en términos de tiempo, ii) establecer nuevas secuencias de pulsos que faciliten el estudio de constantes de acoplamiento a larga distancia fundamentales para la elucidación estructural, y iii) el desarrollo de un método fiable que permita el análisis diferenciado de enantiómeros (enantioespecífico) directamente en la mezcla de la que forma parte originariamente (in situ) y de múltiples moléculas simultáneamente (multicomponente). Los experimentos de RMN desarrollados usando el enfoque de MFA (Multiple Fid Acquisition) basado en el “afterglow magnetization”, permiten una considerable disminución del tiempo experimental mediante la adquisición de varios experimentos a la vez, que son almacenados en diferentes FIDs y se pueden visualizar por separado. En esta tesis se presentan varios trabajos que permiten hacer una elucidación estructural de moléculas orgánicas de una forma rápida, sencilla y sin ambigüedades entre ellos, como son MFA-COSY/RELAY3, MFA-COSY/TOCSY, MFA-HMBC/HMBC-COSY, MFA-MBOB-COSY, MFA-TOCSY/TOCSY, MFA-HSQC/HSQC y el MFA-HSQC/Pure-shiftHSQC. Además, con una adecuada combinación de MFA y “Spectral Aliasing” (SA), se presenta un nuevo experimento, que además del tiempo experimental mejora la resolución espectral y facilita la identificación estructural. El SA, a pesar de ser un poderoso experimento para evitar solapamiento de las señales tiene una importante desventaja relacionada con la identificación de cada señal.Para evitar este problema, con unos segundos extra, adquirimos los dos experimentos heteronucleares en 2D, el HSQC con “Spectral Aliasing” y el HSQC estándar para facilitar la asignación de señales. Además, en términos de mejora de la resolución espectral, en esta tesis se presentan dos experimentos esencialmente siguiendo la metodología de Pure-shift para eliminar la constante de acoplamiento protón-protón, usando BIRD (BIlinear Rotation Decoupling) para realizar el desacoplamiento heteronuclear, minimizando el solapamiento de señales. La novedad de este trabajo se basa en la detección de múltiples núcleos en el mismo espectro de 2D, nitrógeno y carbono en la dimensión indirecta (F1) y protón en F2, es lo que se conoce como “Time-Shared NMR experiments”. Además, usando el mismo enfoque, se presenta un segundo experimento que permite el cálculo (via observación directa) de las constantes heteronucleares de acoplamiento protón-carbono y protón-nitrógeno simultáneamente. El reto en la espectroscopía de RMN es la medida de constantes de acoplamiento heteronucleares a larga distancia, ya que son valores muy pequeños, y por tanto difíciles de medir. Una modificación en el LR-HSQMBC (cambio de unos pulsos de 180º del experimento por pulsos selectivos irradiados en una zona del espectro), permite la medida de constantes de acoplamiento muy pequeñas (de hasta 6 enlaces de separación). En este trabajo se exponen las ventajas de este nuevo experimento, LR-selHSQMBC, y además se comparan explicando las ventajas y desventajas de ambos experimentos. Finalmente, en esta tesis se presenta un trabajo innovador relacionado con la detección enantioespecífica y simultánea de múltiples pares de enantiómeros en una mezcla sin previa separación ni derivatización de los componentes de la muestra y con una mínima manipulación de esta. Este método se basa en espectroscopia de RMN y se fundamenta en el uso de un auxiliar quiral tipo agente de solvatación quiral (CSA). En este trabajo se muestra como prueba de concepto la enantiodiferenciación simultánea por RMN de múltiples pares de enantiómeros directamente en su matriz original.

This thesis presented by compendium of articles and entitled “Advances in NMR spectroscopic methodology and applications: time-efficient methods, ultralong-range heteronuclear correlation experiments and enantiospecific analysis of complex mixtures”, is divided into the following topics: i) the development of Nuclear Magnetic Resonance (NMR) experiments focused on efficiency in terms of time, ii) establishing new pulse sequences that facilitate the study of long-distance coupling constants fundamental for structural elucidation, iii) the development of a reliable method that allows the differentiated analysis of enantiomers (enantiospecific) directly from its original mixture (in situ) and from multiple molecules simultaneously (multicomponent). The NMR experiments developed using the MFA (Multiple Fid Acquisition) approach based on the “afterglow magnetization”, allows a considerable reduction of the experimental time by acquiring several experiments at the same time, which are stored in different FIDs that can be visualized separately. In this thesis several works are presented that allow to make a structural elucidation of organic molecules in a fast, simple and unambiguous way, among them MFA-COSY / RELAY3, MFA-COSY / TOCSY, MFA-HMBC / HMBC-COSY, MFA-MBOB -COSY, MFA-TOCSY / TOCSY, MFA-HSQC / HSQC and the MFA-HSQC / Pure-shiftHSQC. Furthermore, with an adequate combination of MFA and “Spectral Aliasing” (SA), a new experiment is presented, which in addition to the experimental time improves spectral resolution and facilitates structural identification. The SA, despite being a powerful experiment to avoid signal overlapping has an important disadvantage related to the identification of each signal, to avoid this problem, for a few extra seconds, we acquired the two heteronuclear experiments in 2D, the HSQC with “Spectral Aliasing” and the standard HSQC to facilitate signal assignment. Furthermore, in terms of improving the spectral resolution, this thesis presents two experiments following the Pure-shift methodology to eliminate the proton-proton coupling constant, using BIRD (BIlinear Rotation Decoupling) to perform heteronuclear decoupling, minimizing signal overlapping. The novelty of this work is based on the detection of multiple nuclei in the same 2D spectrum, nitrogen and carbon in the indirect dimension (F1) and proton in F2, is what is known as “Time-Shared NMR experiments”. In addition, using the same approach, a second experiment is presented that allows the calculation (via direct observation) of the heteronuclear proton-carbon and proton-nitrogen coupling constants simultaneously. The measurement of long-distance heteronuclear coupling constants remains a challenge in NMR spectroscopy, due to their tiny values and to the difficulty of their measurement. A modification in the LR-HSQMBC (changing some 180º pulses of the experiment by selective pulses irradiated in an area of the spectrum) allows the measurement of very small coupling constants (of up to 6 separation bonds). In this work, the advantages of the new LR-selHSQMBC NMR experiment are exposed and the advantages and disadvantages of both experiments are compared. Finally, this thesis presents an innovative work related to the enantiospecific and simultaneous detection of multiple pairs of enantiomers in a mixture without prior separation or derivatization of the sample components and with minimal sample manipulation. This method is based on NMR spectroscopy and on the use of a chiral solvating agent (CSA) as chiral auxiliary. This work shows, as a proof of concept, the simultaneous enantiospecific detection of multiple enantiomeric pairs directly within the original mixture. This is demonstrated with an aqueous mixture of the essential amino acids in their D and L forms.