Papel de las células natural killer en la eliminación de los reservorios celulares del vih y uso de la nanotecnología para potenciar su función

Abstract

El Virus de la Immunodeficiència Humana (VIH) causa una infecció persistent que altera el sistema immunitari de les persones infectades, i representa una patologia incurable a dia d’avui. El tractament antiretroviral (TAR) disponible contra el virus és altament efectiu suprimint la càrrega viral per sota del límit de detecció de les tècniques comercials actuals, reduïnt substancialment la mortalitat i morbiditat associada a la infecció. No obstant això, el TAR no és capaç d’eliminar completament el VIH del cos humà. Això és degut, principalment, a la presència de reservoris cel·lulars, com són les cèl·lules T CD4+, que contenen genomes virals majoritàriament en estat de latència, i que no són susceptibles al TAR ni a l’acció del sistema immunitari. Com a conseqüència, un cop discontinuat el tractament, la càrrega viral en sang augmenta novament i arriba a nivells detectables en qüestió de setmanes. Per aquesta raó, les noves estratègies dirigides a eliminar aquests virus, un cop revertida la latència, són una prioritat en la investigació contra el VIH. Recentment, l’estratègia terapèutica anomenada “shock and kill” està sent àmpliament explorada per a tal d’assolir aquesta fita, i consisteix en la inducció farmacològica de l’expressió viral i la posterior eliminació pels efectes citopàtics del virus o per diferents mecanismes immunològics. En aquest sentit, l’ús in vivo de fàrmacs reversors de la latència ha aconseguit una reactivació parcial del virus, però, en cap dels assajos clínics duts a terme fins al moment s’ha observat una disminució significativa del reservori, posant de manifest la necessitat de potenciar el sistema immune dels pacients VIH+. Per tant, les noves aproximacions terapèutiques que inclouen l’adreçament del sistema immunitari a les cèl·lules VIH+ reactivades són crucials en l’intent d’erradicar la infecció viral. En aquest sentit, les cèl·lules Natural Killer (NK), per la varietat i potència de mecanismes immunes que són capaços d’intervenir, són un candidat atractiu per al desenvolupament d’inmunoteràpies contra el VIH. En la present tesi, es descriu, en primer lloc, l’existència d’un grup de cèl·lules reservori, les quals expressen la molècula CD32, amb capacitat per evadir la resposta immune mediada per cèl·lules NK. Específicament, aquestes cèl·lules T CD4+ CD32+ aconsegueixen escapar en assajos ex vivo al mecanisme de control mediat per immunoglobulines que és conegut com a ADCC. A més, presenten major potencial de proliferació en resposta a complexos immunes, la qual cosa podria facilitar la seva persistència en l’organisme. En segon lloc, s’ha desenvolupat una nova nano-eina consistent en nanopartícules d’or biespecífiques (BiAb-AuNPs), carregades amb dos anticossos específicament dirigits a les cèl·lules VIH+ reactivades i a les cèl·lules NK. A més, s’ha desenvolupat un mètode de conjugació que assoleix l’adsorció cooperativa dels anticossos sobre la nanopartícula, aconseguint una disposició ordenada dels mateixos en dominis, fet que facilita el contacte cel·lular específic. Els resultats mostren la capacitat de les BiAb-AuNPs per penetrar en el teixit limfoide ex vivo i reduir la infecció viral, així com de potenciar l’eliminació mediada per les cèl·lules NK de les cèl·lules que actuen com a reservori després de la reactivació viral. En conclusió, els resultats revelen un mecanisme d’evasió de la resposta immune NK per part de la subpoblació de cèl·lules reservori CD32+, amb implicacions per al disseny de noves teràpies dirigides a erradicar els reservoris virals, i el potencial d’un format biespecífic, multivalent i polaritzat com les BiAb-AuNPs, per a la seva aplicació en estratègies de “shock and kill”.

El Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) causa una infección persistente que altera el sistema inmune de las personas infectadas, y representa una patología incurable a día de hoy. El tratamiento antirretroviral (TAR) disponible contra el virus es altamente efectivo en suprimir la carga viral por debajo del límite de detección de las técnicas comerciales actuales, reduciendo sustancialmente la mortalidad y morbidez asociada a la infección. Sin embargo, el TAR no es capaz de eliminar completamente el VIH del cuerpo humano. Esto es debido principalmente a la presencia de reservorios celulares, principalmente células T CD4+, que albergan genomas virales en su mayoría en estado de latencia, y que no son susceptibles al TAR ni a la acción del sistema inmunitario. Como consecuencia, una vez discontinuado el tratamiento, el VIH rebota de los citados reservorios y alcanza niveles detectables en cuestión de semanas. Por esta razón, nuevas estrategias dirigidas a eliminar estos virus, una vez revertida la latencia, son una prioridad en la investigación contra el VIH. Recientemente, la estrategia terapéutica denominada “shock and kill” está siendo ampliamente explorada para tal fin, y consiste en la inducción farmacológica de la expresión viral y la posterior eliminación por los efectos citopáticos del virus o por distintos mecanismos inmunes. En este sentido, el uso in vivo de fármacos reversores de la latencia ha conseguido una reactivación parcial del virus, sin embargo, en ninguno de los ensayos clínicos llevados a cabo hasta el momento se ha observado una disminución significativa del reservorio, resaltando la necesidad de potenciar el sistema inmune de los pacientes VIH+. Por lo tanto, nuevas aproximaciones terapéuticas integrando también el direccionamiento del sistema inmunitario a las células VIH+ reactivadas son cruciales en el intento de erradicar la infección viral. En este sentido, las células Natural Killer (NK), por la variedad y potencia de mecanismos inmunes que son capaces de mediar, son un candidato atractivo para el desarrollo de inmunoterapias contra el VIH. En la presente tesis, se describe en primer lugar, la existencia de un grupo de células reservorio, las cuales expresan la molécula CD32, con capacidad para evadir la respuesta inmune mediada por células NK. Específicamente, estas células T CD4+ CD32+ consiguen escapar en ensayos ex vivo al mecanismo de control mediado por inmunoglobulinas conocido como ADCC. Además, presentan mayor potencial de proliferación en respuesta a complejos inmunes, lo cual podría facilitar su persistencia en el organismo. En segundo lugar, se ha desarrollado un nuevo nanosistema consistente en nanopartículas de oro biespecíficas (BiAb-AuNPs), cargadas con dos anticuerpos específicamente dirigidos a las células VIH+ reactivadas y a las células NK. Además, se ha desarrollado un método de conjugación que logra la adsorción cooperativa de los anticuerpos sobre la nanopartícula, consiguiendo una disposición ordenada de los mismos en dominios, que facilita el contacto celular específico. Los resultados muestran la capacidad de las BiAb-AuNPs para penetrar en el tejido linfoide ex vivo y reducir la infección viral, así como de potenciar la eliminación mediada por células NK de las células reservorio tras la reactivación viral. En conclusión, los resultados revelan un mecanismo de evasión de la respuesta inmune NK por parte de la subpoblación de células reservorio CD32+, con implicaciones para el diseño de nuevas terapias dirigidas a erradicar los reservorios virales, y el potencial de un formato biespecífico, multivalente y polarizado como las BiAb-AuNPs, para su aplicación en estrategias de “shock and kill”.

The Human Immunodeficiency Virus (HIV) causes a persistent infection that impact the immune system of infected people, and represents an incurable disease today. Currently available antiretroviral treatment (ART) is highly effective in suppressing HIV replication below the limit of detection of current commercial assays, significantly reducing the mortality and morbidity associated with the infection. However, ART is not able to completely eliminate HIV from the human body. This is mainly due to the presence of cellular reservoirs, mainly CD4+ T cells, which harbor viral genomes, mostly in a dormant state, and which are not susceptible to ART or the action of the immune system. As a consequence, once treatment is interrupted, HIV rebounds from the aforementioned reservoirs and reaches detectable levels in a matter of weeks. For this reason, new strategies aimed at eliminating these viruses, once latency is reversed, are a priority in HIV research. For this purpose, therapeutic strategies called “shock and kill” are being explored, and consists of the pharmacological induction of viral expression and subsequent elimination by viral cytopathic effects or different immune mechanisms. In this sense, the in vivo use of latency-reversal agents has been modestly successful at reactivating the virus; however, none of the clinical trials carried out to date has achieved a significant decrease in the reservoir size, highlighting the need for enhance the immune system of HIV+ patients. Thus, new therapeutic approaches also guiding the immune system towards reactivated HIV+ cells are crucial in the attempt to eradicate the HIV infection. In this sense, Natural Killer (NK) cells, due to the varied and potent mechanisms of action, are an attractive candidate for the development of HIV immunotherapies. Here, we show first the existence of a subpopulation of HIV reservoir cells, with expression of the molecule CD32, which have the ability to evade the NK-mediated immune response. Specifically, these CD4+ CD32+ T cells manage to escape in ex vivo assays the immunoglobulin-mediated control mechanism known as ADCC. In addition, they have a greater proliferative potential in response to immune complexes, which could facilitate their persistence in the body. Second, a new nano-tool has been developed consisting of bispecific gold nanoparticles (BiAb-AuNPs), loaded with two antibodies specifically directed at reactivated HIV+ cells and NK cells. Furthermore, a conjugation method has been developed that achieves the cooperative adsorption of the antibodies on the nanoparticle, leading to an ordered arrangement of them in domains, which facilitates specific cell contact. The results show the ability of BiAb-AuNPs to penetrate lymphoid tissue ex vivo and reduce viral infection, as well as to enhance NK cell-mediated clearance of reservoir cells after viral reactivation. In conclusion, the results reveal a mechanism of evasion of the NK immune response by the subpopulation of CD32+ reservoir cells, with implications for the design of new therapies aimed at eradicating viral reservoirs, and the potential of a bispecific, multivalent and polarized platform like the BiAb-AuNPs, for their application in shock and kill strategies.