Obtención de aptámeros específicos para enzimas de la vía del metileritritol fosfato de microorganismos

Abstract

FUNDAMENTO: Microorganismos patógenos como las bacterias Mycobacterium tuberculosis y Pseudomonas aeruginosa, y los protozoos del filo Apicomplexa, incluyendo los agentes causantes de la malaria y la toxoplasmosis, sintetizan los precursores isoprenoides isopentenil difosfato (IPP) y dimetilalil difosfato (DMAPP), por la vía del metileritritol fosfato (MEP). Esta vía es esencial para la mayoría de las bacterias y Apicomplexa, pero no está presente en los seres humanos, que sintetizan IPP y DMAPP por la vía alternativa del mevalonato. El papel esencial de la vía MEP y su distribución en diferentes organismos hacen que sus enzimas sean objetivos atractivos para el desarrollo de nuevos agentes antiinfecciosos. Aquí, nos centramos en el desarrollo de aptámeros contra enzimas clave de la vía MEP. Los aptámeros son oligonucleótidos monocatenarios que se comportan como "anticuerpos químicos" y pueden unirse de manera específica y eficiente a una molécula diana determinada. MÉTODOS: Se han optimizado varios métodos, tales como: (i) la producción de enzimas de la vía MEP, (ii) el desarrollo de aptámeros a través de la evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial, un proceso de selección in vitro basado en ciclos iterativos de unión, partición y amplificación de oligonucleótidos a partir de un conjunto de secuencias variantes, (iii) la clonación de aptámeros, (iv) el establecimiento de un ensayo de cambio de motilidad electroforética (EMSA) para la identificación de interacciones entre aptámeros seleccionados y sus enzimas diana, y (v) métodos para la evaluación in vitro de la actividad enzimática. RESULTADOS: Se informa de la identificación de un aptámero de ADN (D10) que se une específicamente a la enzima 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (DXR) de Plasmodium falciparum, que cataliza la segunda etapa de la vía del metileritritol fosfato (MEP) de biosíntesis de isoprenoides. Se ha demostrado que el aptámero D10 interacciona con la DXR de Plasmodium y también con la de Escherichia coli. Además, produce un efecto inhibidor sobre la actividad enzimática de las preparaciones de la enzima de E. coli. Los resultados obtenidos por microscopía confocal y citometría de flujo demuestran que el aptámero D10 marca específicamente los eritrocitos infectados por P. falciparum tanto en las fases iniciales como tardías y que su capacidad para discriminar los eritrocitos infectados de los no infectados es equiparable a la de otros marcadores específicos. En la segunda parte de la tesis se han obtenido aptámeros contra el tercer enzima de la vía del MEP, la 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol sintasa de E. coli combinando el método de selección convencional y una estrategia de selección basada en el enfoque de esfera única. CONCLUSIONES: Los experimentos demuestran que el aptámero D10 podría ser utilizado como un nuevo aptasensor para la localización del apicoplasto, un orgánulo importante como diana de compuestos antimaláricos; y además como un candidato potencial para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos y para el diseño de nuevos sistemas de diagnóstico.

BACKGROUND: Pathogenic microorganisms such as the bacteria Mycobacterium tuberculosis and Pseudomonas aeruginosa, and the protozoa of the phylum Apicomplexa, including the causing agents of malaria and toxoplasmosis, synthesize the isoprenoid precursors isopentenyl diphosphate (IPP) and dimethylallyl diphosphate (DMAPP), by the methylerythritol phosphate (MEP) pathway. This pathway is essential for most bacteria and Apicomplexa, but it is not present in humans, which synthesize IPP and DMAPP by the alternative mevalonate pathway. The essential role of the MEP pathway and its distribution in different organisms make their enzymes attractive targets for the development of new anti-infective agents. Herein, we focus on the development of aptamers against key enzymes of the MEP pathway. Aptamers are single-stranded oligonucleotides which behave as “chemical antibodies” and can bind specifically and efficiently to a given target molecule. METHODS: Several methods have been optimized, such as: (i) the production of MEP pathway enzymes, (ii) the development of aptamers through systematic evolution of ligands by exponential enrichment, an in vitro selection process based on iterative cycles of binding, partitioning, and amplification of oligonucleotides from a pool of variant sequences, (iii) the cloning of aptamers, (iv) the establishment of an electrophoretic motility shift assay for the identification of interactions between selected aptamers and their target enzymes, and (v) methods for the in vitro evaluation of enzymatic activity. RESULTS: We report the identification of a DNA aptamer (D10) which specifically binds to the enzyme catalyzing the

first committed step of the MEP pathway: 1-deoxy-D-xylulose-5- phosphate reductoisomerase (DXR). CONCLUSIONS: The results obtained suggest that the D10 DNA aptamer could be a potential candidate for the development of new therapeutic agents and for the design of novel diagnosis systems.