Neutrophilic asthma modelling and translational markers

Abstract

Els models animals d’inflamació al·lèrgica de les vies respiratòries són eines útils per a estudiar la patogènia de l’asma. L’objectiu d’aquest treball ha estat establir un model d’asma murí a través de procediments patogènics propers als reals que permetin representar diferents perfils inflamatoris de les vies respiratòries com s’observa en la pràctica clínica, proporcionant un conjunt d’eines per a la comparació, investigació dels mecanismes de la malaltia i identificació de nous objectius diagnòstics o terapèutics. Triem per a aquest propòsit el ratolí C57BL / 6J, un cep consanguínia no esbiaixada Th2, l’àcar de la pols domèstica (HDM) com aeroalergeno, i instil·lacions intranasales com a via d’administració. Comencem amb la recerca de dosi combinada amb proves de durada d’exposició a al·lèrgens. Trobem evidències d’una resposta immune adaptativa impulsada per cèl·lules T en una configuració de dosi alta, 4 setmanes (4W), com es reflecteix en l’augment de cèl·lules T i la producció d’IgE específica d’HDM, juntament amb una resposta inflamatòria eosinofílica i neutrofílica i 1 hiperreactivitat de les vies respiratòries. Exposicions més prolongades van conduir a una disminució de la resposta de les cèl·lules T i a l’anul·lació de la hiperreactivitat de les vies respiratòries i els infiltrats eosinofílics, el que suggereix inmunorregulación per Th2. A partir d’aquestes dades, vam triar el protocol 4W de dosi alta encara que aquest model no aconseguís generar remodelació de les vies respiratòries. Amb l’objectiu de representar la remodelació de les vies respiratòries, vam provar l’administració de HDM en combinació amb SEB o α-galactosilceramida. L’addició de SEB va provocar la remodelació de les vies respiratòries però va inhibir la hiperreactivitat de les vies respiratòries i la infiltració de cèl·lules T CD4 +, i el α-Galcer no va aconseguir reproduir tots els trets cardinals de l’asma. Per tant, cap estratègia assoliment generar models d’asma competents que incloguin la remodelació de les vies respiratòries. Trobem que els antígens DerP1 i DerP2 de l’extracte HDM estandarditzat i reconstituït, pateixen degradació. Els antígens aeroalergénicos poden, per tant, patir una degradació espontània en condicions ambientals que condueixen a canvis conformacionals que modifiquen la resposta immunitària. Controlar l’estat de conservació de l’HDM, l’ús d’al·lèrgens parcialment degradats (model H4) va induir inflamació neutrofílica dominant, mentre que els antígens conservats (model H20) van provocar inflamació eosinofílica dominant. Tots dos models van mostrar evidència d’una resposta immune adaptativa impulsada per cèl·lules T CD4 + amb funcionalitat Th2 que va conduir a la producció d’IgE específica d’HDM i van desenvolupar amb èxit la inflamació i remodelació de les vies respiratòries. Anàlisi cinètics dels resultats de la resposta immune, van mostrar patrons complexos que variaven al llarg de el temps i eren concordants amb els perfils eosinòfils versus neutrofílicos. Aquesta desviació de el model H20-eosinofílico davant H4-neutròfil abasta una àmplia representació dels perfils inflamométricos observats en la pràctica clínica. Emprant aquests models, el fenotipat dels eosinòfils i neutròfils infiltrants per marcadors de superfície cel·lular relacionats amb la maduració, migració i activitat proinflamatòria versus immunomoduladora (Ly6, CD11b, SiglecF) ens va permetre identificar subpoblacions que variaven i fluctuaven al llarg de el temps. Aquestes subpoblacions canviants probablement s’involucrin implicacions funcionals encara no identificades.

Los modelos animales de inflamación alérgica de las vías respiratorias son herramientas útiles para estudiar la patogenia del asma. El objetivo de este trabajo ha sido establecer un modelo de asma murino a través de procedimientos patogénicos cercanos a los reales que permitan representar diferentes perfiles inflamatorios de las vías respiratorias como se observa en la práctica clínica, proporcionando un conjunto de herramientas para la comparación, investigación de los mecanismos de la enfermedad e identificación de nuevos objetivos diagnósticos o terapéuticos. Elegimos para este propósito el ratón C57BL/6J, una cepa consanguínea no sesgada Th2, el ácaro del polvo doméstico (HDM) como aeroalergeno, e instilaciones intranasales como vía de administración. Comenzamos con la búsqueda de dosis combinada con pruebas de duración de exposición a alérgenos. Encontramos evidencias de una respuesta inmune adaptativa impulsada por células T en una configuración de dosis alta, 4 semanas (4W), como se refleja en el aumento de células T y la producción de IgE específica de HDM, junto con una respuesta inflamatoria eosinofílica y neutrofílica e una hiperreactividad de las vías respiratorias. Exposiciones más prolongadas condujeron a una disminución de la respuesta de las células T y a la anulación de la hiperreactividad de las vías respiratorias y los infiltrados eosinofílicos, lo que sugiere inmunorregulación por Th2. A partir de estos datos, elegimos el protocolo 4W de dosis alta aunque este modelo no lograse generar remodelación de las vías respiratorias. Con el objetivo de representar la remodelación de las vías respiratorias, probamos la administración de HDM en combinación con SEB o α-galactosilceramida. La adición de SEB provocó la remodelación de las vías respiratorias pero inhibió la hiperreactividad de las vías respiratorias y la infiltración de células T CD4+, y el α-Galcer no logró reproducir todos los rasgos cardinales del asma. Por lo tanto, ninguna estrategia logro generar modelos de asma competentes que incluyan la remodelación de las vías respiratorias. Encontramos que los antígenos DerP1 y DerP2 del extracto HDM estandarizado y reconstituido, sufren degradación. Los antígenos aeroalergénicos pueden, por tanto, sufrir una degradación espontánea en condiciones ambientales que conducen a cambios conformacionales que modifican la respuesta inmunitaria. Controlando el estado de conservación del HDM, el uso de alérgenos parcialmente degradados (modelo H4) indujo inflamación neutrofílica dominante, mientras que los antígenos conservados (modelo H20) provocaron inflamación eosinofílica dominante. Ambos modelos mostraron evidencia de una respuesta inmune adaptativa impulsada por células T CD4+ con funcionalidad Th2 que condujo a la producción de IgE específica de HDM y desarrollaron con éxito la inflamación y remodelación de las vías respiratorias. Análisis cinéticos de los resultados de la respuesta inmune, mostraron patrones complejos que variaban a lo largo del tiempo y eran concordantes con los perfiles eosinófilos versus neutrofílicos. Esta desviación del modelo H20-eosinofílico frente a H4-neutrófilo abarca una amplia representación de los perfiles inflamométricos observados en la práctica clínica. Empleando estos modelos, el fenotipado de los eosinófilos y neutrófilos infiltrantes por marcadores de superficie celular relacionados con la maduración, migración y actividad proinflamatoria versus inmunomoduladora (Ly6, CD11b, SiglecF) nos permitió identificar subpoblaciones que variaban y fluctuaban a lo largo del tiempo. Estas subpoblaciones cambiantes probablemente involucren implicaciones funcionales aún no identificadas.

Animal models of allergic airway inflammation are helpful tools to study the pathogenesis of asthma and potential therapeutic interventions. Despite the long use of experimental asthma models, the nature of allergen-driven experimental asthma and allergen delivery route with the use of adjuvants may be distant from human allergic sensitization and the physiopathology of actual asthma. The aim of this work has been to establish a murine asthma model through close-to-real pathogenic procedures that allow representing different airway inflammatory profiles as seen in clinical practice, with their associated cardinal disease traits, providing an extended set of tools for the comparative investigation of disease mechanisms and, eventually, identifying novel diagnostic or therapeutic targets. We chose for this purpose the C57BL/6J mouse, a non-Th2-biased inbred strain, house dust mite (HDM) as a relevant aeroallergen in human asthma, and intranasal (i.n.) instillations for an inhalational delivery route. We started with dose-finding experiments combined with allergen exposure length testing. We found evidence of a T-cell driven adaptive immune response in a High-dose, 4-week (4W) setup as reflected by increased CD3+ CD4+ T cells and the production of HDM-specific IgE, along with a mixed eosinophilic and neutrophilic inflammatory infiltrate, and airway hyperresponsiveness. Longer exposures (6 weeks) led to a declined T-cell response and abrogation of airway hyperresponsiveness and the eosinophilic infiltrates, suggesting immunoregulation on the Th2 arm. From the data of these experiments, we chose the High-dose 4W protocol for further development, although this model still failed to generate airway remodeling. Aiming at representing airway remodeling, we tested delivering HDM in combination with Staphylococcus aureus enterotoxin-B (SEB) or α-galactosylceramide (α-Galcer). The addition of SEB elicited airway remodeling but inhibited airway hyperresponsiveness and CD4+ T-cell infiltration, and α-Galcer failed to reproduce all cardinal asthma traits. Thus, both strategies failed to generate competent asthma models encompassing airway remodeling. By Western blot analysis, we found that the DerP1 and DerP2 antigens undergo degradation in standardized, reconstituted HDM extract. Aeroallergen antigens may, therefore, undergo spontaneous degradation in environmental conditions leading to conformational changes that modify the immune response. By controlling the HDM preservation status, the use of partially degraded allergens (hereinafter termed H4 model) induced dominant neutrophilic inflammation, whereas preserved antigens (H20 model) elicited dominant eosinophilic inflammation. Both models showed evidence of a CD4+ T cell-driven adaptive immune response with Th2 functionality leading to HDM- specific IgE production and successfully developed airway inflammation and remodeling. The latter differed in its patterns, i.e., mucoid with increased airway contractile tissue mass in the H20 eosinophilic model versus fibrotic remodeling in the neutrophilic model. Upon kinetics analyses of immune response outcomes, these diverging models showed complex patterns that varied through time and were concordant with the eosinophilic versus neutrophilic profiles. This H20-eosinophilic versus H4-neutrophilic model diversion encompasses a broad representation of inflammometric profiles seen in real- world clinical practice. Employing these models, kinetic phenotyping of the infiltrating eosinophils and neutrophils by cell surface markers related to maturation, migration, and proinflammatory versus immunomodulatory activity (Ly6, CD11b, SiglecF) allowed us to identify subpopulations that varied between the models and fluctuated across time. These changing subpopulations likely involve functional implications not yet identified. Finally, we performed proteomics in murine BAL and induced sputum from asthmatics. Overall, the proteomics data support that the H4 and H20 models are driven by close-to- human’s immune responses. We identify immune response-related gene expression patterns with some differences from proteins previously linked to atopic asthma and some proteins differing between eosinophilic and neutrophilic asthma. Further study of gene expression differing between the inflammatory profiles may point towards targets of potential diagnostic or therapeutic value.