Drug development and immunological characterization of Acinetovax, a prophylactic vaccine against resistant nosocomial bacteria Acinetobacter baumannii

Abstract

Aquesta tesi industrial tenia com a objectiu transferir la vacuna Acinetovax duna companyia biotecnològica a una companyia farmacèutica on pogués ser industrialitzada. Aquesta vacuna va ser desenvolupada per prevenir les infeccions provocades per un cep d’A. baumannii en entorns nosocomials. A. baumannii és un bacteri oportunista que ha aconseguit desenvolupar resistències a antibiòtics i ha esdevingut un problema hospitalari internacional. És per aquesta raó que per millorar la protecció contra les infeccions provocades per A. baumannii en ambients nosocomials, una vacuna innovadora anomenada Acinetovax està sent desenvolupada. La vacuna Acinetovax ha estat desenvolupada per Vaxdyn i va ser transferida a Reg Jofre. Les vacunes profilàctiques tenen incomptables problemes durant el seu desenvolupament i per a la venda al mercat ja que s’inoculen en individus sans per evitar infeccions, la qual cosa pot provocar, en alguns casos, esdeveniments adversos. Aquest escenari força els productes per ser més segurs i més efectius que altres productes ja que moltes vegades la ràtio reg benefici és molt baix. Les eines per estudiar l’efectivitat de les vacunes són limitades, i la majoria se centren a caracteritzar la resposta immune produïda. Els assaigs preclínics realitzats amb vacunes per prevenir infeccions basades en models animals permeten al científic estudiar la supervivència després de la infecció, analitzar la resposta immune cel·lular induïda a la melsa i els ganglis limfàtics, o estudiar la resposta humoral a través de la determinació d’immunoglobulines . Tot i que, a l’etapa clínica, l’única forma d’avaluar la resposta immune és a partir de mostres de sèrum, per la qual cosa és essencial desenvolupar mètodes ELISA sèrics robustos. El primer pas en la transferència va consistir a desenvolupar una bateria de tècniques analítiques basades en lanàlisi de la resposta humoral a la vacuna i validar el mètode seguint pautes internacionals. El principal mètode analític desenvolupat com un ELISA sandvitx per quantificar al producte farmacèutic, la proteïna immunodominant Omp22. Un segon objectiu va ser desenvolupar i estudiar la forma farmacèutica de la vacuna. Es van dissenyar diversos lots per optimitzar la fórmula i es van estudiar amb les tècniques desenvolupades. L’objectiu principal de la nova formulació va ser assolir un producte farmacèutic estable que pogués mantenir la seva capacitat protectora. Es va demostrar que la fórmula era estable amb l’evidència obtinguda a través de les tècniques analítiques validades. El tercer objectiu va consistir a estudiar la resposta immune induïda per la vacuna. La resposta humoral es va estudiar en un model murí de sepsi que va mesurar la supervivència i la producció d’anticossos específics en sèrum. La determinació dels diferents isotips d’IgG i IgM mitjançant una prova ELISA, a banda de mostrar resultats robusts, és essencial per a l’inici de la fase clínica de la vacuna. La resposta immune cel·lular es va analitzar mitjançant citometria de flux, on es van estudiar les citocines produïdes pels esplenocits de ratolins immunitzats. No obstant això, els resultats dels assaigs de secreció de citocines no van ser tan robusts. En resum, es van assolir la majoria dels objectius de la tesi i es va aconseguir una fórmula farmacèutica òptima per al començament dels estudis fase clínics, el següent pas del procediment de desenvolupament.

Esta tesis industrial tenía como objetivo transferir la vacuna Acinetovax de una compañía biotecnológica a una compañía farmacéutica donde pudiese ser industrializada. Esta vacuna fue desarrollada para prevenir las infecciones provocadas por una cepa de A. baumannii en entornos nosocomiales. A. baumannii es una bacteria oportunista que ha conseguido desarrollar resistencias a antibióticos y se ha convertido en un problema hospitalario internacional. Es por esta razón que para mejorar la protección contra las infecciones provocadas por A. baumannii en ambientes nosocomiales, una vacuna innovadora llamada Acinetovax esta siendo desarrollada. La vacuna Acinetovax ha sido desarrollada por Vaxdyn y fue transferida a Reg Jofre. Las vacunas profilácticas tienen incontables problemas durante su desarrollo y para su venta en el mercado ya que se inoculan en individuos sanos para evitar infecciones, lo cual puede provocar, en algunos casos, eventos adversos. Este escenario fuerza a los productos para ser mas seguros y mas efectivos que otros productos ya que muchas veces la ratio riego beneficio es muy bajo. Las herramientas para estudiar la efectividad de las vacunas son limitadas, y la mayoría de ellas se centran en caracterizar la respuesta inmune producida. Los ensayos preclínicos realizados con vacunas para prevenir infecciones basadas en modelos animales permiten al científico estudiar la supervivencia después de la infección, analizar la respuesta inmune celular inducida en el bazo y los ganglios linfáticos, o estudiar la respuesta humoral a través de la determinación de inmunoglobulinas. Aunque, en la etapa clínica, la única forma de evaluar la respuesta inmune es a partir de muestras de suero, por lo que es esencial desarrollar métodos ELISA séricos robustos. El primer paso en la transferencia consistió en desarrollar una batería de técnicas analíticas basadas en el análisis de la respuesta humoral a la vacuna y validar el método siguiendo pautas internacionales. El principal método analítico desarrollado como un ELISA sándwich para cuantificar en el producto farmacéutico, la proteína inmunodominante Omp22. Un segundo objetivo fue desarrollar y estudiar la forma farmacéutica de la vacuna. Se diseñaron varios lotes para optimizar la fórmula y se estudiaron con las técnicas desarrolladas. El objetivo principal de la nueva formulación fue lograr un producto farmacéutico estable que pudiera mantener su capacidad protectora. Se demostró que la fórmula era estable con la evidencia obtenida a través de las técnicas analíticas validadas. El tercer objetivo consistió en estudiar la respuesta inmune inducida por la vacuna. La respuesta humoral se estudió en un modelo murino de sepsis que midió la supervivencia y la producción de anticuerpos específicos en suero. La determinación de los diferentes isotipos de IgG e IgM a través de una prueba ELISA, a parte de mostrar resultados robustos, es esencial para el inicio de la fase clínica de la vacuna. La respuesta inmune celular se analizó mediante citometría de flujo, donde se estudiaron las citoquinas producidas por los esplenocitos de ratones inmunizados. Sin embargo, los resultados de los ensayos de secreción de citoquinas no fueron tan robustos. En resumen, se lograron la mayoría de los objetivos de la tesis y se consiguió una formula farmacéutica óptima para el comienzo de los estudios fase clínicos, el siguiente paso del procedimiento de desarrollo.

This industrial Ph.D. thesis aimed to transfer the vaccine Acinetovax from a biotechnological company to a pharmaceutical company where it could be industrialized. This vaccine has been developed to prevent infections by A. baumannii resistant strains in nosocomial environments. This is an opportunistic bacterium that has developed antibiotic resistances and is nowadays a real problem in hospitals worldwide. Therefore, to improve the protection to A. baumannii infections in these environments, an innovative vaccine, Acinetovax, was developed by the company Vaxdyn and was transferred to the pharmaceutical company Reig Jofre in order to develop the final formulation of the drug product that could be tested and eventually administered.

Prophylactic vaccines have countless issues during their development and their market phases because they are inoculated into healthy individuals to prevent infections and can provoke, in some cases, adverse effects. This scenario forces these products to be safer and more effective than other drugs. The tools to study the effectiveness of the vaccines are limited, and most of them are centered on characterizing the immune response induced. The use of animal models in pre- clinical assays using vaccines to prevent infections allows scientists to monitor survival after infection, to analyze the cellular immune response induced in spleen and the lymph nodes, or to study the humoral response through immunoglobulin determination. On the contrary, in the clinical stage, the only way to evaluate the immune response is on sera samples, so it is essential to develop robust ELISA methods. The first step in the transference process consisted of developing a battery of analytical techniques based on the humoral response induced by the vaccine and validate the method following international guidelines. The main analytical method developed was a sandwich ELISA to quantify in the pharmaceutical product, the immunodominant protein identified, Omp22. A second objective was to develop and characterize the pharmaceutical formulation of the vaccine. Several batches were designed to optimize the formula and were tested with the developed techniques. The main objective of the new formulation was to achieve a stable drug product that could maintain its protective capacity. The stability of the developed formulation was demonstrated with evidence obtained through the analytical techniques validated.

The third objective was to study the immune response induced by the vaccine. The humoral immune response was studied in an in vivo mice model of sepsis measuring survival and specific antibody production in serum. ELISA determination of the different IgG and IgM isotypes, in addition to showing robust results, is essential for the initiation of the clinical phase of the vaccine. The cellular immune response was analyzed by flow cytometry, where cytokines produced by splenocytes of immunized mice were determined. In summary, most of the objectives of the thesis were achieved and the work conducted to a vaccine formulation better prepared to enter the clinical phase, the next step of the developmental procedure.