Bacterial composition and dynamics of active communities in an anammox reactor treating wastewater at mainstream conditions

Abstract

Aquesta tesi s’ha desenvolupat en el marc del projecte HIPATIA, amb l’objectiu de demostrar la viabilitat operativa d’un reactor que tracta aigües residuals reals en condicions de línia principal d’aigües a temperatures baixes. L’objectiu principal d’aquest treball és conèixer els canvis a la comunitat microbiana d’un reactor anammox quan es treballa en condicions de línia principal d’aigües, per comprendre el desenvolupament del sistema durant els canvis operacionals que enfronta el procés. Les tècniques moleculars es fan servir àmpliament per estudiar comunitats microbianes en el procés anammox, però no sempre es tenen en compte els biaixos en la seva aplicació. La primera part d’aquesta tesi va consistir en l’avaluació, la comparació i l’estandardització de diferents enfocaments moleculars per estudiar comunitats bacterianes en un reactor anammox de llit de llots de flux ascendent (UAnSB) de biomassa granular que funciona en condicions de línia principal d’aigües i en un reactor de càrrega seqüencial (SBR) que funciona en condicions controlades amb aigües residuals sintètiques. Totes les tècniques avaluades es van estandarditzar generant, entre d’altres, un protocol optimitzat d’hibridació fluorescent in situ-FISH per reduir l’autofluorescència de la mostra i l’elecció d’encebadors per a seqüenciació d’amplicons i qPCR. A partir de la primera anàlisi filogenètica, proposem una nova espècie anammox, anomenada “Candidatus” Brocadia barcinensis. Es va estudiar l’estructura i dinàmica de les comunitats microbianes i anammox durant un gradient decreixent de temperatura (20ºC a 10ºC) al reactor UAnSB en tres seccions del llit de llots al llarg de l’alçada del reactor. Es va trobar un “microbioma central” amb les mateixes classes predominants malgrat la disminució de la temperatura. Els canvis a l’estructura de la comunitat microbiana van mostrar estratificació al llarg del reactor. Es va detectar més abundància relativa de bacteris anammox a la base del reactor, però l’augment d’aquests a 10°C no té correspondència amb la taxa específica d’eliminació de nitrogen (sNRR). Aleshores, calia informació més fiable per confirmar la hipòtesi de sobrecapacitat del reactor, recorrent a l’estudi de les comunitats actives. Es va determinar la dinàmica de les comunitats bacterianes i anammox actives al llarg del reactor UAnSB durant la disminució de la temperatura d’operació (20ºC a 10ºC). Es van registrar canvis a l’estratificació a causa de l’efecte de la temperatura. Aquests canvis al llarg del reactor donen suport al concepte de sobrecapacitat. La comunitat anammox activa va mostrar una diferenciació de gènere al llarg del reactor, que podria ser responsable de mantenir l’eficiència d’eliminació a temperatures baixes. A més, l’abundància de Ca. Brocadia barcinensis activa va augmentar a baixes temperatures. Així, les diferents capacitats fisiològiques de les espècies anammox podrien influir en l’exercici del reactor a cada temperatura i secció del llit de llots. Finalment, per determinar el rol dels grups bacterians predominants, utilitzem metagenòmica centrada en genomes per obtenir genomes representatius des dels reactors anammox SBR i UAnSB, i estudiem el potencial metabòlic de microorganismes dels ordres Brocadials i Ignavibacterials. S’obtingueren set genomes acoblats de metagenomes (MAGs) d’alta qualitat. Un dels MAGs de Brocadiales es va agrupar al mateix clado de la nostra nova espècie, Ca. Brocadia barcinensis i se’n va determinar el potencial metabòlic. Quant a Ignavibacteriales, se’n va estudiar el potencial metabòlic i es van confirmar les interaccions amb bacteris anammox. La gran quantitat de dades bioinformàtiques adquirides permetrà investigacions futures com l’estudi del potencial metabòlic del metagenoma dels reactors UAnSB. També es podrien generar investigacions que tinguin en compte una avaluació contínua de les comunitats actives en diferents condicions d’operació per comprendre els canvis en la dinàmica dels consorcis anammox. Finalment, seria interessant utilitzar nous enfocaments moleculars com la metatranscriptòmica per estudiar l’expressió de les funcions metabòliques identificades davant de determinades condicions d’operació.

Esta tesis ha sido desarrollada en el marco del proyecto HIPATIA, con el objetivo de demostrar la viabilidad operativa de un reactor de que trata aguas residuales reales en condiciones de línea principal de aguas a bajas temperaturas. El objetivo principal de este trabajo es conocer los cambios en la comunidad microbiana de un reactor anammox cuando se trabaja en condiciones de línea principal de aguas, para comprender el desempeño del sistema durante los cambios operacionales que enfrenta el proceso. Las técnicas moleculares se utilizan ampliamente para estudiar comunidades microbianas en el proceso anammox, pero no siempre se tienen en cuenta los sesgos en su aplicación. La primera parte de esta tesis consistió en la evaluación, comparación y estandarización de diferentes enfoques moleculares para estudiar comunidades bacterianas en un reactor anammox de lecho de lodos de flujo ascendente (UAnSB) de biomasa granular que funciona en condiciones de línea principal de aguas y en un reactor de carga secuencial (SBR) que funciona en condiciones controladas con aguas residuales sintéticas. Todas las técnicas evaluadas se estandarizaron generando, entre otros, un protocolo optimizado de hibridación fluorescente in situ-FISH para reducir la autofluorescencia de la muestra y la elección de cebadores para secuenciación de amplicones y qPCR. A partir del primer análisis filogenético, proponemos una nueva especie anammox, denominada “Candidatus” Brocadia barcinensis. Se estudió la estructura y dinámica de las comunidades microbianas y anammox durante un gradiente decreciente de temperatura (20ºC a 10ºC) en el reactor UAnSB en tres secciones del lecho de lodos a lo largo de la altura del reactor. Se encontró un “microbioma central” con las mismas clases predominantes a lo largo de las secciones del lecho de lodos pese a la disminución de la temperatura. Los cambios en la estructura de la comunidad microbiana mostraron estratificación a lo largo del reactor. Se detectó una mayor abundancia relativa de bacterias anammox en la base del reactor, pero el aumento de éstas a 10°C no tiene correspondencia con la tasa específica de eliminación de nitrógeno (sNRR). Entonces, se necesitaba información más confiable para confirmar la hipótesis de sobrecapacidad del reactor, recurriendo al estudio de las comunidades activas. Se determinó la dinámica de las comunidades bacterianas y anammox activas a lo largo del reactor UAnSB durante la disminución de la temperatura de operación (20ºC a 10ºC). Se registraron cambios en la estratificación debido al efecto de la temperatura. Estos cambios a lo largo del reactor respaldan el concepto de sobrecapacidad. La comunidad anammox activa mostró una diferenciación de género a lo largo del reactor, que podría ser responsable de mantener la eficiencia de eliminación a bajas temperaturas. Además, la abundancia de Ca. Brocadia barcinensis activa aumentó a bajas temperaturas. Así, las diferentes capacidades fisiológicas de las especies anammox podría influir en el desempeño del reactor a cada temperatura y sección del lecho de lodos. Finalmente, para determinar el rol de los grupos bacterianos predominantes, utilizamos metagenómica centrada en genomas para obtener genomas representativos desde los reactores anammox SBR y UAnSB, y estudiamos el potencial metabólico de microorganismos de los órdenes Brocadiales e Ignavibacteriales. Se obtuvieron siete genomas ensamblados de metagenomas (MAGs) de alta calidad. Uno de los MAGs de Brocadiales se agrupó en el mismo clado de nuestra nueva especie, Ca. Brocadia barcinensis y se determinó su potencial metabólico. En cuanto a Ignavibacteriales, se estudió su potencial metabólico y se confirmaron las interacciones con bacterias anammox. La gran cantidad de datos bioinformáticos adquiridos permitirá futuras investigaciones como el estudio del potencial metabólico del metagenoma en los reactores UAnSB. También se podrían generar investigaciones que contemplen una evaluación continua de las comunidades activas en diferentes condiciones de operación.

This thesis has been developed within the framework of the HIPATIA project, aiming to demonstrate the operational viability of an anammox reactor treating real mainstream wastewater at low temperatures. Thus, the main objective of this work is to know the changes in the microbial community of an anammox reactor when working at mainstream conditions to understand the performance of the system during the operational changes the process has suffered. Molecular techniques are widely used to study microbial communities in the anammox process, but biases on its application are not always considered. Therefore, the first part of this thesis consisted of evaluation, comparison, and standardization of different molecular approaches to study bacterial communities in a granular-sludge Upflow Anammox Sludge Blanket (UAnSB) reactor working at mainstream conditions and in a Sequencing Batch Reactor (SBR) working at controlled conditions with synthetic wastewater. All evaluated techniques were standardized generating, among others, an optimized Fluorescent in situ hybridization-FISH protocol to overcome sample autofluorescence and a proper choice of the primer sets for amplicon sequencing and qPCR. From the first phylogenetic analysis, we propose a new species of anammox, namely “Candidatus” Brocadia barcinensis. The structure and dynamics of the whole microbial and anammox communities during a decreasing gradient of temperature from 20ºC to 10ºC in the UAnSB reactor were studied in three sludge bed sections along the reactor height. A “core microbiome” with the same predominant classes was found along the different sludge bed sections of the reactor despite the temperature decrease, but changes in the microbial community structure showed stratification along the reactor. The higher relative abundance of anammox bacteria was detected in the base of the reactor. Nevertheless, the increase of anammox relative abundance at 10ºC has no correspondence with the calculated specific Nitrogen Removal Rate (sNRR). Thus, more reliable information was needed to explain and confirm the hypothesis of reactor overcapacity with the study of its active communities. Thus, the dynamics of active bacterial and anammox communities along the UAnSB reactor during the decrease of the operating temperature from 20ºC to 10ºC was determined. Changes in stratification due to the temperature effect were recorded and the community dynamics variation along the reactor support the reactor overcapacity concept. The active anammox community showed a genus differentiation along the reactor, which could be responsible for keeping the removal efficiency at low temperatures. In addition, the abundance of active Ca. Brocadia barcinensis increased at low temperatures. Therefore, the different physiological abilities of each anammox species might be influencing the reactor’s performance at each temperature and sludge bed section. Finally, to fill the gaps in determining the role of the predominant bacterial groups, we applied genome-centric metagenomics to obtain representative genomes to study the metabolic potential of microorganisms from the Brocadiales and Ignavibacteriales orders from the SBR and UAnSB anammox-reactors. Seven metagenomics assembled genomes (MAGs) of high quality were obtained. One of the Brocadiales MAG bunched in the same clade of our recently proposed new species, Ca. Brocadia barcinensis and its metabolic potential was determined. Regarding the Ignavibacteriales, its metabolic potential was studied and the interactions with anammox bacteria were confirmed. The high amount of bioinformatic data acquired through this thesis, would allow future investigations as the study of the metabolic potential of the metagenome along the UAnSB reactors. Futures lines of research could be achieved with a continuous assessment of the active communities to understand changes in the dynamics of the anammox consortia, and finally, the use of new approaches as metatranscriptomics would be necessary to study the expression of the identified metabolic functions under certain operational conditions.