Study of molecular determinants involved in the Classical swine fever virus attenuation and the persistence in the host

Abstract

La pesta porcina clàssica (PPC) és una de les malalties més importants que afecta la indústria porcina. El seu agent etiològic, el virus de la PPC (VPPC), segueix essent prevalent a diverses zones del món, sobretot les soques de baixa i moderada virulència. Aquests tipus de soques virals estan associades a la generació de formes cròniques i persistents, que dificulten els programes de control en països endèmics, i fan de l’eradicació de la PPC tot un repte. Tenint en compte l’estudi dels determinants moleculars associats a la virulència del VPPC, esdevenen molt rellevants per al desenvolupament de les vacunes i d’eines diagnòstiques eficaces que en garanteixin el control. La present tesi ha investigat la implicació en virulència de la seqüència única i ininterrompuda de 36 poliuridines (poli-U) dins la regió 3’ no codificant (3’UTR), presents en l’aïllat de VPPC de baixa virulència Pinar del Río (PdR). Per fer-ho, es va utilitzar l’estratègia de genètica reversa per a generar dos virus derivats de l’ADNc de la soca PdR. Un dels virus duia el poli-U de 36 nucleòtids en el 3’UTR (vPdR-36U), mentre que l’altre, contenia només les 5 uridines estàndard pel VPPC en aquesta posició (vPdR-5U). Es van infectar diferents grups de garrins de cinc dies de vida i es va demostrar que, la seqüència de 36 poli-U del 3’UTR de la soca PdR, redueix la capacitat de replicació del virus in vivo i la seva capacitat de transmissió, a més d’activar la resposta innata de l’hoste. Per tant, el poli-U en el fragment 3’UTR, és un factor de virulència del VPPC. D’altra banda, la glicoproteïna Erns, present exclusivament en els pestivirus, té la característica única de tenir activitat ribonucleasa (RNasa). No obstant, el seu paper en la patogènesi i la resposta immunològica, així com la seva relació amb la capacitat de generar infeccions cròniques i persistents, ha estat poc estudiada. El segon estudi d’aquesta tesi va avaluar el rol de l’activitat RNasa de la soca PdR en la patogènesi, la replicació viral i la transmissibilitat en porcs de 5 dies. Partint del clon vPdR-36U, es va construir el vPdR-H30K-36U, al qual se li va inactivar la funció RNasa de l’Erns. Aquest virus va resultar ser atenuat en replicació i en la seva capacitat de transmissió. No obstant, va activar de forma eficaç la resposta immune innata i adaptativa en els garrins infectats. El mutant va generar nivells més elevats d’anticossos contra les glicoproteïnes E2 i Erns i d’anticossos neutralitzants, en comparació amb la capacitat de generar resposta humoral del vPdR-36U; evidenciant així que la Erns està involucrada en mecanismes d’evasió de la resposta immune de l’hoste, resultant problemàtica la seva utilització en sistemes de diagnòstic. En el tercer estudi, es va demostrar el paper sinèrgic de l’activitat RNasa de la Erns i la inserció del poli-U descrit en 3’UTR. Un cop duta a terme la inoculació en animals amb el nou virus generat, vPdR-H30K-5U, es va demostrar el seu rol regulador en la resposta innata de l’hoste, així com en la capacitat de replicació del virus in vivo. La infecció amb aquest virus va generar una alta mortalitat en garrins, amb un increment de replicació del virus a la tonsil·la. De la mateixa manera, es va detectar un dràstic increment en la resposta de citoquines proinflamatòries a nivell sistèmic, associant-se amb la mortalitat i severitat de la malaltia. Aquesta tesi marca una nova direcció en el camí dels dissenys d’estratègies DIVA front al VPPC. A més proporciona una nova metodologia per a l’estudi dels factors de virulència del virus i una millor comprensió de la patogènesi de la PPC.

La peste porcina clásica (PPC) es una de las enfermedades más importantes que afecta la industria porcina. Su agente etiológico, el virus de la PPC (VPPC), continúa siendo prevalente en diversas zonas del mundo, principalmente las cepas de baja y moderada virulencia. Este tipo de cepas virales están asociadas con la generación de formas crónicas y persistentes, las que complican los programas de control en los países endémicos, representando un desafío para la erradicación de la PPC. Teniendo en cuenta, el estudio de los determinantes moleculares asociados a la virulencia del VPPC, son de gran relevancia para el desarrollo de vacunas y herramientas diagnósticas eficaces que garanticen el control. La presente tesis ha investigado la implicación en virulencia de la secuencia única e ininterrumpida de 36 poli-uridinas (poli-U) dentro de la región 3’ no codificante (3’UTR) presentes en el aislado de VPPC de baja virulencia Pinar de Río (PdR). La estrategia de genética reversa se utilizó para generar un par de virus derivados del ADNc de la cepa de baja virulencia PdR. Uno de los virus llevó el poli-U de 36 nucleótidos en el 3’UTR (vPdR-36U), mientras que el segundo, contenía solamente las 5 uridinas estándar para VPPC en esta posición (vPdR-5U). Se infectaron diferentes grupos de cerditos de cinco días de nacidos y se demostró, que la secuencia de 36 poli-U del 3’UTR de la cepa PdR, reduce la capacidad de replicación del virus in vivo, su capacidad de transmisión, además de activar la respuesta innata del hospedador. Por lo tanto, el poli-U en el fragmento 3’UTR, es un factor de virulencia del VPPC. Por otro lado, la glicoproteína Erns, presente exclusivamente en los pestiviruses, tiene una característica única de tener actividad ribonucleasa (RNasa). No obstante, su papel en la patogénesis y la respuesta inmune, así como su relación con la capacidad de generar infecciones crónicas y persistentes, ha sido poco estudiado. El segundo estudio de esta tesis evaluó el rol de la actividad RNasa de la cepa PdR, en la patogénesis, la replicación viral y la transmisibilidad en cerdos de cinco días. Partiendo del clon vPdR-36U, se construyó el vPdR-H30K-36U, al cual se le inactivó la función RNasa de la Erns. Este virus resultó ser atenuado en replicación y en su capacidad de transmisión. No obstante, activó de forma eficaz la respuesta inmune innata y adaptativa en los lechones infectados. El mutante generó niveles más altos de anticuerpos contra las glicoproteínas E2 y Erns y de anticuerpos neutralizantes, en comparación con la capacidad de generar respuesta humoral del vPdR-36U. Evidenciando que la Erns está involucrada en mecanismos de evasión de la respuesta inmune del hospedador, siendo problemática su utilización en sistemas de diagnóstico. En el tercer estudio, se demostró el papel sinérgico de la actividad RNasa de la Erns y la inserción del poli-U descrito en 3’UTR. Tras la inoculación en animales con el nuevo virus generado, vPdR-H30K-5U, se demostró su rol regulador en la respuesta innata del hospedador; así como en la capacidad de replicación del virus in vivo. La infección con este virus generó una alta mortalidad en cerditos, con un incremento en la replicación del virus en tonsila. Del mismo modo, se detectó un drástico incremento en la respuesta de citoquinas proinflamatorias a nivel sistémico, asociándose con la mortalidad y severidad de la enfermedad. Esta tesis marca una nueva dirección en el camino de los diseños de estrategias DIVA frente al VPPC. Además, proporciona una nueva metodología para el estudio de los factores de virulencia del virus y una mejor comprensión de la patogénesis de la PPC.

dustry worldwide. The prevalence of low and moderate virulence CSFV strains under vaccination programs could induce unapparent disease forms and facilitate virus persistence in the field, posing a challenge for CSF eradication. Therefore, the study of CSFV molecular determinants in virulence is highly relevant for the development of solid diagnostic tools and vaccines to ensure effective disease control. The present thesis has investigated the role of a unique, uninterrupted 36 poly-uridines (poly-U) sequence found in the 3’ untranslated region (3’UTR) of the low virulence CSFV isolate Pinar de Rio (PdR) for CSFV virulence and transmissibility in 5-day-old pigs. The reverse genetics approach was used to construct a pair of cDNA-derived viruses based on the PdR backbone, one carrying the long poly-U insertion in the 3’UTR (vPdR-36U) and the other harbouring the standard 5 uridines at this position (vPdR-5U). The infection with both viruses showed that the long poly-U insertion in the PdR strain can control viral replication, reduce disease severity and activate immunity in the infected piglets without affecting viral transmission, being a CSFV virulence factor. In addition, the unique Ribonuclease (RNase) activity from the exclusive Erns glycoprotein of Pestivrius has been associated with the high virulence pestiviruses attenuation in vivo, however, the role of this function in low virulence CSFV strains pathogenesis remains unknown. Therefore, this thesis evaluated the role of the Erns RNase activity from the low virulence CSFV PdR strain in pathogenesis, viral replication and transmissibility in 5-day-old pigs. The Erns RNase inactivated clone, vPdR-H30K-36U, was constructed based on the vPdR-36U backbone. The vPdR-H30K-36U virus was attenuated in piglets compared to the parental vPdR-36U, showing for the first time that Erns RNase inactivation in a low virulence CSFV PdR strain could reduce viral replication capacity and CSFV persistence and transmissibility in the infected animals. The vPdR-H30K-36U mutant activated the innate immune response in the infected piglets. Likewise, infection with vPdR-H30K-36U resulted in higher antibody levels against the E2 and Erns glycoproteins and enhanced neutralizing antibody response when compared with vPdR-36U. This dampening effect on Erns-specific immunity related to the RNase activity of Erns may bring difficulties in the development of differentiability of infected from vaccinated animals (DIVA) assays based on seroconversion against Erns. Moreover, the potential synergistic role of the Erns RNase activity and the poly-U insertion in the 3’UTR from PdR strain in the innate and adaptive immunity regulation and its relationship with the disease pathogenesis in 5-day-old and 3-week-old pigs was assessed. A double mutant vPdR-H30K-5U with Erns RNase inactivation and with 5 uridines instead of the 36 in the 3’UTR was generated. The lack of both, the poly-U insertion and the Erns RNase function could induce severe clinical manifestations in two infected groups, higher mortality rate was shown in 5-day-old piglets (89.5%) than in 3-week-old pigs (33.3%). The pigs infected with vPdR-H30K-5U showed high viral replication in tonsils but mild viremia and low viral excretion. Among nine cytokines quantified, only IFN-α and IL-12 were highly elevated in the two groups. Additionally, high IL-8 levels were found in the newborn but not in the older pigs, indicating the important role of these cytokines for the CSFV disease severity. Additionally, infection with vPdR-H30K-5U resulted in the reduced adaptive immune response from the pigs. These results from the present thesis provide new potential targets for the development of novel vaccines and diagnostic tools for efficient CSF control. Moreover, it gives a better understanding for CSF pathogenesis and provides new directions for the study of the natural CSFV attenuation molecular determinants.