On the road to improve glioblastoma therapy follow-up. Immune microenvironment: what is behind the MRSI-based nosological images?

Abstract

El glioblastoma (GB) és un tumor cerebral agressiu amb escassa supervivència. Calen amb urgència millores tant en les estratègies terapèutiques com de seguiment. Nosaltres hem descrit un patró oscil·latori de resposta a la temozolomida (TMZ) detectat a través d’enfocaments d’aprenentatge automàtic basats en imatges espectroscòpiques de ressonància magnètica (MRSI) en tractar ratolins C57BL/6j portadors de tumors GL261 amb el cronograma metro el sistema immunitari (IMS), que consisteix en una administració de TMZ cada 6 dies. A més, vam observar que la teràpia IMS produeix una millora significativa en la supervivència dels ratolins, superant el tractament estàndard amb TMZ. Alhora, els tumors d’alguns ratolins (n=6) van desaparèixer del tot i van romandre indetectables sense tractament addicional durant un mes. Aquests animals es van considerar “curats” i se’ls va reexposar a GL261, sense reaparició del tumor en 5 dels 6 casos. Tenint en compte que 1) el microambient tumoral és un element clau en l’evolució del GB i la resposta a la teràpia, 2) la població de microglia/macròfags associada al glioma (GAM) constitueix el tipus de cèl·lula no tumoral més abundant del GB, i 3) el lligand 1 de mort programada (PD-L1) i el seu receptor (PD-1) són un dels mecanismes que intervenen en la immunosupressió en GB, hem analitzat la polarització de GAM i l’expressió del gen PD-L1 dins del microambient tumoral. Com a resultat, hem observat una polarització més gran de GAM cap a un fenotip antitumoral en els tumors tractats en comparació amb els tumors control. A més, l’expressió de PD-L1 va ser més gran en els tumors tractats i el seu nivell d’expressió es va correlacionar amb el fenotip antitumoral dels GAM. Això ens porta a pensar que el canvi oscil·latori en la població de GAM podria ser una de les causes del patró diferencial detectat per MRSI, cosa que permet que aquest actuï com un biomarcador de l’activitat del sistema immunitari. Les metal·loproteïnases de matriu (MMP) i les ‘Desintegrines i Metal·loproteïnases A’ (ADAM) estan involucrades en la regulació del microambient tumoral i estan associades amb funcions dels GAMs en GB. Hem analitzat tumors de ratolins tractats amb IMS-TMZ que van respondre o no al tractament, tumors recidivants i controls, per caracteritzar les diferents subpoblacions d’expressió gènica de GAMs i PD-L1, així com el perfil molecular de diferents gens de proteases associats amb la progressió del GB (ADAM8, ADAM10, ADAM17, MMP9 i MMP14). En aquest sentit, hem detectat un augment en la infiltració de GAMs i el canvi al fenotip antitumoral, així com un augment en els gens ADAM8, ADAM10, ADAM17, MMP14 i PD-L1, en tumors responedors en comparació amb els tumors de control, recidivants i no responedors. Per contra, la polarització cap a un fenotip antitumoral va augmentar significativament en situacions de proliferació activa, facilitant la progressió del GB. Finalment, es va trobar que el nivell d’expressió del gen MMP9 augmenta als tumors que no responen en comparació amb altres grups. D’altra banda, s’ha descrit el paper crucial dels diferents limfòcits (Th, Tc, Treg i cèl·lules NK) en el creixement del tumor i la resposta al tractament. Hem analitzat aquestes cèl·lules en mostres de ratolins tractats amb IMS-TMZ i vehicle, i s’ha observat que les poblacions percentuals de Tc, Th, Treg i NK augmenten en ratolins responedors. Tots aquests resultats donen suport a la idea que l’activació del sistema immunitari de l’hoste està estretament relacionada amb el resultat beneficiós assolit amb els programes terapèutics d’IMS-TMZ i podria explicar, com a mínim parcialment, els canvis al patró espectral observats per MRSI. Es necessitaran més estudis per aclarir elements moleculars/cel·lulars addicionals que expliquin les troballes descrites.

El glioblastoma (GB) es un tumor cerebral agresivo con escasa supervivencia. Se necesitan con urgencia mejoras tanto en las estrategias terapéuticas como de seguimiento. Nosotros describimos un patrón oscilatorio de respuesta a la temozolomida (TMZ) detectado a través de enfoques de aprendizaje automático basados en imágenes espectroscópicas de resonancia magnética (MRSI) al tratar ratones C57BL/6j portadores de tumores GL261 con el cronograma metronómico de mejora inmunológica respetuoso con el sistema inmunitario (IMS), que consiste en una administración de TMZ cada 6 días.Además, observamos que la terapia IMS produjo una mejora significativa en la supervivencia de los ratones, superando el tratamiento estándar con TMZ. Al mismo tiempo, los tumores de algunos ratones (n=6) desaparecieron por completo y permanecieron indetectables sin tratamiento adicional durante un mes. Estos animales se consideraron “curados” y se les reexpuso a GL261, sin reaparición del tumor en 5 de los 6 casos. Teniendo en cuenta que 1) el microambiente tumoral es un elemento clave en la evolución del GB y la respuesta a la terapia, 2) la población de microglía/macrófagos asociada al glioma (GAM) constituye el tipo de célula no tumoral más abundante del GB, y 3) el ligando 1 de muerte programada (PD-L1) y su receptor (PD-1) son uno de los mecanismos que median la inmunosupresión en GB, analizamos la polarización de GAM y la expresión del gen PD-L1 dentro del microambiente tumoral. Observamos una mayor polarización de GAM hacia un fenotipo antitumoral en los tumores tratados en comparación con los tumores control. Además, la expresión de PD-L1 fue mayor en los tumores tratados y su nivel de expresión se correlacionó con el fenotipo antitumoral de los GAMs. Esto nos lleva a pensar que el cambio oscilatorio en la población de GAMs podría ser una de las causas del patrón diferencial detectado por MRSI, lo que permite que este actúe como un biomarcador de la actividad del sistema inmunitario. Las metaloproteinasas de matriz (MMP) y las ‘Desintegrinas y Metaloproteinasas A’ (ADAM) están involucradas en la regulación del microambiente tumoral y están asociadas con funciones de los GAMs en GB. Analizamos tumores de ratones tratados con IMS-TMZ que respondieron o no al tratamiento, tumores recidivantes y controles, para caracterizar las diferentes subpoblaciones de expresión génica de GAMs y PD-L1, así como el perfil molecular de diferentes genes de proteasas asociados con la progresión del GB (ADAM8, ADAM10, ADAM17, MMP9 y MMP14). Encontramos un aumento en la infiltración de GAMs y su cambio al fenotipo antitumoral, así como un aumento en los genes ADAM8, ADAM10, ADAM17, MMP14 y PD-L1, en tumores respondedores en comparación con los tumores de control, recidivantes y no respondedores. Por el contrario, la polarización hacia un fenotipo antitumoral aumentó significativamente en situaciones de proliferación activa, facilitando la progresión del GB. Finalmente, se encontró que el nivel de expresión del gen MMP9 aumenta en los tumores que no responden en comparación con otros grupos. Se ha descrito el papel crucial de los diferentes linfocitos (Th, Tc, Treg y células NK) en el crecimiento del tumor y la respuesta al tratamiento. Analizamos estas células en muestras de ratones tratados con IMS-TMZ y vehículo. Las poblaciones porcentuales de Tc, Th, Treg y NK aumentan en ratones respondedores. Todos estos resultados respaldan la idea de que la activación del sistema inmunitario del huésped está estrechamente relacionada con el resultado beneficioso alcanzado con los programas terapéuticos de IMS-TMZ y podría explicar, al menos parcialmente, los cambios en el patrón espectral observados por MRSI. Se necesitarán más estudios para aclarar elementos moleculares/celulares adicionales que expliquen los hallazgos descritos.

Glioblastoma (GB) is an aggressive brain tumour with poor survival. Improvements in both therapeutic and follow-up strategies are urgently needed. In this work, we described an oscillatory pattern of response to Temozolomide (TMZ) detected through magnetic resonance spectroscopic imaging (MRSI)-based machine learning approaches when treating GL261 GB tumour-bearing C57BL/6j mice with the immune respectful Immune-Enhancing Metronomic Schedule (IMS), that consists in an every 6-days TMZ administration. These results suggest that host immune response has a relevant role in therapy response/escape in GL261 tumours under IMS-TMZ therapy since the oscillatory pattern length matches with immune cycle length, which would be being sampled by MRSI-derived nosological images. Furthermore, we observed that IMS-TMZ therapy produced significant improvement in mice survival, outperforming standard TMZ treatment. Moreover, during IMS-TMZ treatment, tumours from some mice (n=6) fully regressed and remained undetectable without further treatment for one month. These animals were considered “cured” and a GL261 re-challenge experiment was performed, with no tumour reappearance in 5 out of 6 cases. Considering that 1) the tumour microenvironment is a key element in GB evolution and response to therapy, 2) the glioma-associated microglia/macrophage (GAM) population constitutes the most abundant non-tumour cell type within the GB, and 3) the Programmed Death Factor 1 ligand (PD-L1) and its receptor (PD-1) are one of the mechanisms mediating immunosuppression in GB, we analysed the GAM polarisation and PD-L1 gene expression within the glioblastoma microenvironment. We observed that GAM polarisation towards an anti-tumour phenotype prevailed in TMZ treated tumours compared to control tumours. Moreover, PD-L1 expression was higher in treated tumours and its expression level was correlated with the antitumour GAM phenotype. GAMs can represent up to 30–40% of the GB tumour volume, which leads us to think that the oscillatory change in the GAMs population could be one of the key causes for the differential MRSI-detected pattern, allowing this to act as immune system activity biomarker. Matrix Metalloproteinases (MMPs) and ‘A Disintegrin and Metalloproteinase’ (ADAMs) are involved in tumour microenvironment regulation and are associated with microglia/macrophage functions in GB. Their analyses could provide insight into the molecular signature of these cells and might be a predictor of GB patients’ survival. We analysed tumours from IMS-TMZ treated mice either responding or non-responding to treatment, as well as relapsing and vehicle-treated tumours, in order to characterise the different subpopulations of GAMs and PD-L1 gene expression, as well as the molecular profile of different protease genes, known to be associated with GB progression (ADAM8, ADAM10, ADAM17, MMP9 and MMP14). We found an increase in GAM infiltration and its shift to antitumour phenotypes, as well as ADAM8, ADAM10, ADAM17, MMP14 and PD-L1 genes increased, in mice responding to IMS-TMZ therapy compared to control, relapsing and non-responding tumours. On the opposite, the antitumoural phenotype was significantly increased in actively proliferation situations, supporting tumour progression. Finally, the MMP9 gene expression level was found to increase in non-responding tumours in comparison with other groups. It has been described the crucial role of the different lymphocytes (Th cells, Tc cells, Treg cells and NK cells) in cancer growth and response to treatment. We analysed these cells in responding samples from GL261 tumour-bearing mice treated with IMS-TMZ and vehicle. Tc, Th, Treg and NK percentage populations increase in IMS-TMZ treated responding mice. All these results support the idea that the host immune system activation is closely related to the beneficial outcome reached from IMS-TMZ therapeutic schedules and could at least partially explain spectral pattern changes observed by the MRSI-based biomarker. Further studies will be needed in order to clarify additional molecular/cellular elements explaining the MRSI-based findings.