Characterizing Canine Glioma as a Naturally Occurring Model for Immune Evasion in Human Glioma

Abstract

Els gliomes humans exploten vies inhibitòries del sistema inmune per suprimir la inmunitat antitumoral. Es urgent caracteritzar la contribució del sistema inmune a la biologia dels gliomes per poder desenvolupar noves teràpies que millorin els resultats del tractament actual a medicina humana. Calen models animals que recapitulin els gliomes humans amb fidelitat. Els models amb ratolins han fracasat a l’hora de predir quins tractaments eficaços en estudis preclínics són efectius a la clínica. El gos s’està postulant com un model prometedor pels gliomes humans degut al tamany i l’estructura del seu encèfal, l’alta incidència de gliomes espontanis, i la coexistència amb un sistema inmune actiu. Per validar el glioma caní com a model del glioma humà però, cal resoldre moltes incògnites de la seva biologia natural, així com del seu inmunofenotip. La unió entre la proteïna de mort cel·lular programada 1 (PD-1) i el seu lligand (PD-L1) promou l’esgotament i apoptosi de les cèl·lules-T activades. Les cèl·lules tumorals (TCs) evadeixen l’atac inmune del seu hoste expressant PD-L1 i induint l’expressió de PD-1 als linfòcits que infiltren el tumor (TILs). L’acumulació intratumoral de cèl·lules-T reguladores (Tregs) també resulta en la disminució de la resposta antitumoral. Aquests mecanismes d’expressió de PD-1-PD-L1 i acumulació de Tregs son clau per l’evasió del sistema inmune en gliomes humans. Aquí, analitzem les característiques epidemiològiques, clíniques, diagnòstiques, i la supervivència de 91 gossos amb glioma i evaluem les associacions amb el tipus i grau histològic dels tumors. A més, evaluem l’expressió inmunohistoquímica de Tregs i el punt de control del sistema inmune PD-PD-L1 en 43 i 21 gliomes canins, respectivament. Tot i les diferències entre espècies en la distribució dels subtipus de tumor (els gliomes astrocítics son més freqüents en persones i els oligodendrogliomes en gossos), hem trobat varies similituds clau entre gossos i humans com la localització del tumor al còrtex cerebral, una edat mitja-avançada al diagnòstic, predilecció pels mascles, i crisis convulsives com a signe detonant del diagnòstic. Encara que no hem trobar associacions entre cap troballa clinicopatològica o la supervivència i el tipus o grau de glioma, les teràpies més definitives varen proporcionar una supervivència mitja superior al tractament paliatiu. En resonància magnètica, els oligodendrogliomes estaven associats a marges ben definits i hipointensitat en T1 en comparació amb els astrocitomes i els gliomes indefinits, i més freqüentment en contacte amb els ventricles que els astrocitomes. L’extensió del tumor a estructures de l’encèfal adjacents estava associada amb glioma d’alt grau. Les crisis convulsives de nova presentació es van associar amb un pronòstic més favorable. L’observació en resonància de marges tumorals irregulars o indefinits, senyal heterogènea del tumor en T2 i metàstasis es varen associar amb una supervivència més curta. L’estudi inmunohistoquímic de l’expresió de Tregs en els nostres gliomes canins va revelar l’infiltració per aquestes cèl·lules en tots els tipus i graus de tumor. L’acumulació de Tregs FOXP3+ va ser més pronunciada en tumors astrocítics que oligodendrogliomes. Vam demostrar l’expresió inmunohistoquímica de PD-1 y PD-L1 en gliomes canins. També vam observar diferents graus d’expresió de PD-L1 en tots els nostres gliomes i els astrocitomes es van associar amb una expressió major que els oligodendrogliomes. L’avaluació inmunohistoquímica de l’infiltrat de TILs va incloure l’avaluació dels subconjunts de TILs CD3+ y CD20+, corresponents a linfòcits-T i -B respectivament. Els TILs CD3+ estaven presents en major número que els CD20+. Els resultats d’aquesta tesi incrementen la informació sobre diagnòstic, resposta al tractament i pronòstic en gliomes canins, essencial per l’avaluació de teràpies. La caracterització de l’acumulació intratumoral de Tregs y l’expressió de PD-L1, demostra que el glioma caní comparteix aquests mecanismes d’evasió del sistema inmune amb el glioma humà.

Los gliomas humanos explotan vías inhibitorias del sistema inmune para suprimir la inmunidad antitumoral. Urge caracterizar la contribución del sistema inmune a la biología de los gliomas para poder desarrollar nuevas terapias que mejoren los resultados del tratamiento actual en medicina humana. Hacen falta modelos animales que recapitulen los gliomas humanos con fidelidad. Los modelos murinos de glioma han fracasado a la hora de predecir qué tratamientos eficaces en estudios preclínicos son efectivos en la clínica. El perro se está postulando como un modelo prometedor para los gliomas humanos debido al tamaño y estructura de su encéfalo, la alta incidencia de gliomas espontáneos, y la coexistencia con un sistema inmune activo. Para validar el glioma canino como modelo del glioma humano, hay que resolver muchas incógnitas sobre su biología natural, así como su inmunofenotipo. La unión entre la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) y su ligando (PD-L1) promueve el agotamiento y apoptosis de las células-T activadas. Las células tumorales (TCs) evaden el ataque inmune de su huésped expresando PD-L1 e induciendo la expresión de PD-1 en los linfocitos que infiltran el tumor (TILs). La acumulación intratumoral de células-T reguladoras (Tregs) también resulta en disminución de la respuesta antitumoral. Estos mecanismos de expresión de PD-1-PD-L1 y acumulación de Tregs son clave para la evasión del sistema inmune en gliomas humanos. Aquí, analizamos las características epidemiológicas, clínicas, diagnósticas, y la supervivencia de 91 perros con glioma y evaluamos las relaciones con el tipo y grado histológico tumoral. Además, evaluamos la expresión inmunohistoquímica de Tregs y el punto de control del sistema inmune PD-PD-L1 en 43 y 21 gliomas caninos, respectivamente. A pesar de las diferencias entre especies en la distribución de los subtipos de tumor (los gliomas astrocíticos son más frecuentes en personas y los oligodendrogliomas en perros), encontramos varias similitudes clave entre perros y humanos como la localización del tumor en el córtex cerebral, una edad media-avanzada al diagnóstico, predilección por los machos, y crisis convulsivas como signo detonante del diagnóstico. Aunque no encontramos asociaciones entre ningún hallazgo clinicopatológico o la supervivencia y el tipo o grado de glioma, las terapias más definitivas proporcionaron una supervivencia media superior al tratamiento paliativo. En resonancia magnética, los oligodendrogliomas estaban asociados a márgenes bien definidos e hipointensidad en T1 en comparación con los astrocitomas y los gliomas indefinidos, y más comúnmente en contacto con los ventrículos que los astrocitomas. La extensión del tumor a estructuras encefálicas adyacentes estaba asociada a glioma de alto grado. Las crisis convulsivas de nueva presentación se asociaron con un pronóstico más favorable. La observación en resonancia de márgenes tumorales irregulares o indefinidos, señal heterogénea del tumor en T2 y metástasis se asociaron a una supervivencia más corta. El estudio inmunohistoquímico de la expresión de Tregs en nuestros gliomas caninos reveló infiltración por estas células en todos los tipos y grados de tumor. La acumulación de Tregs FOXP3+ fue más pronunciada en tumores astrocíticos. Demostramos la expresión inmunohistoquímica de PD-1 y PD-L1 en gliomas caninos. Observamos diferentes grados de expresión de PD-L1 en todos nuestros gliomas y los astrocitomas se asociaron con mayor expresión. La evaluación inmunohistoquímica del infiltrado de TILs incluyó la evaluación de los subconjuntos de TILs CD3+ y CD20+, correspondientes a linfocitos-T y -B respectivamente. Los TILs CD3+ estaban presentes en mayor número que los CD20+. Los resultados de esta tesis incrementan la información sobre diagnóstico, respuesta al tratamiento y pronóstico en gliomas caninos, esencial para la evaluación de terapias. La caracterización de la acumulación intratumoral de Tregs y la expresión de PD-L1, demuestra que el glioma canino comparte estos mecanismos de evasión del sistema inmune con su homólogo humano.

Growing evidence suggests human gliomas exploit immune inhibitory pathways to suppress antitumor immunity. There is an emerging need to characterize the contribution of the immune system to glioma biology so novel treatments can be developed to improve the poor outcomes associated with the current standard of care in human medicine. Thus, animal models that recapitulate human gliomas with fidelity are necessary. Genetically engineered mice are frequently used to model human gliomas; however, murine models of disease have failed to reliably predict which of the therapies that are efficacious in pre-clinical studies will be effective in the clinic. The dog is being postulated as a promising model for human gliomas because of the size and structure of its brain, the high incidence of spontaneous gliomas, and the coexistence with an active immune system. Nevertheless, to validate canine glioma as a model for human glioma, there are many gaps in knowledge related to tumor natural biology as well as its immunologic profile that need to be addressed. Binding of programmed cell death protein 1 (PD-1) to its ligand (PD-L1) promotes activated T-cell exhaustion. Tumor cells (TCs) evade host’s immune attack by expressing PD-L1 and stimulating PD-1 expression on tumor-infiltrating lymphocytes (TILs). Accumulation of intratumoral FoxP3+ regulatory T-cells (Tregs) also results in effector T-cell inhibition and decreased antitumor response. Both, PD-1-PD-L1 immune checkpoint expression and Tregs accumulation are considered central to human glioma immune evasion. We analyzed the epidemiologic features, clinical findings, diagnosis, and survival of a cohort of 91 dogs with glioma and assessed the relationship between these and tumor type and grade. Also, we evaluated the immunohistochemical expression of Tregs and the PD-1-PD-L1 immune checkpoint in a subset of 43 and 21 canine gliomas, respectively. Despite the difference in tumor histologic subtype distribution between species, astrocytic gliomas are most common in humans whereas oligodendrogliomas are most prevalent in dogs, we found several key similarities including tumor location within the cerebral cortex, middle- to old-age at diagnosis, a male sex predilection, and seizures as the common presenting sign prompting diagnosis. Although no associations were found between clinicopathologic findings or survival and canine glioma type or grade, definitive treatments provided improved median survival times (MST) compared to palliative treatment. On magnetic resonance imaging (MRI), oligodendrogliomas were associated with smooth margins and T1-weighted hypointensity compared to astrocytomas and undefined gliomas and were more commonly in contact with the ventricles than astrocytomas. Tumor spread to adjacent brain structures was associated with high-grade glioma. New onset seizures were associated with a more favorable prognosis. By contrast, MRI observed irregular or indistinct tumor margins, T2-weighted heterogeneity and drop metastases were associated with shorter survival. The immunohistochemical study of expression of Tregs in our sample of canine gliomas revealed FOXP3+ Treg infiltration in all tumor types and grades. Additionally, accumulation of FOXP3+ TILs within the tumor was more pronounced in astrocytic than oligodendroglial tumors. We also demonstrated PD-1 and PD-L1 are immunohistochemically detectable in canine gliomas. PD-L1 expression of variable extent was observed in all glioma specimens and astrocytomas were associated with higher levels of expression. Finally, immunohistochemical evaluation of the TIL infiltrate in canine gliomas included the CD3+ and CD20+ TIL subsets, corresponding to T- and B-lymphocytes, respectively. CD3+ TILs were present in higher numbers than CD20+ TILs. FOXP3+ and PD1+ TIL subsets overlapped with CD3+ TILs. The results of this thesis further the current knowledge on canine gliomas diagnosis, outcome and prognosis, critical for assessment of therapies. Additionally, characterization of intratumoral Treg accumulation and PD-L1 expression, demonstrates that spontaneous canine glioma models immune evasion in its human counterpart. This supports the use of canine gliomas in translational human studies.