Antineoplastic effect of CXCR4-targeted protein nanoparticles in head and neck squamous cell carcinoma mouse models

Abstract

El carcinoma escatós de cap i coll (CECC) representa el setè càncer més comú en el món, amb més de 850.000 nous casos i 400.000 morts en 2020. El tractament actual, que inclou una combinació de cirurgia, quimioteràpia i radioteràpia, aconsegueix un control loco-regional de la malaltia. No obstant això, els pacients de CECC continuen en risc de desenvolupar recidives loco-regionals i metàstasis a distància, afectant de manera dramàtica al seu pronòstic i supervivència. A pesar que el tractament per a pacients amb recidives i/o metàstasis ha millorat en els últims anys gràcies a la incorporació d’anticossos monoclonals i immunoteràpia, fins a un 30-40% dels pacients de CECC moren a conseqüència de la malaltia, posant de manifest la necessitat de noves teràpies. En els últims anys, el receptor de quimiocines 4 (CXCR4) ha estat proposat com una prometedora diana terapèutica. CXCR4 es troba sobreexpressat en més de 20 tipus de càncers, entre ells el CECC, i aquesta sobreexpressió ha estat relacionada amb una major proliferació, angiogènesi, invasió i disseminació metastàtica. De manera important, la sobreexpressió de CXCR4 en tumors primaris de CECC està associada amb el desenvolupament de recidives loco-regionals, metàstasis i un pitjor pronòstic dels pacients. En conseqüència, diferents teràpies dirigides a CXCR4 han estat desenvolupades en les últimes dècades, principalment inhibidors de CXCR4, sent l’antagonista de CXCR4 AMD3100 (plerixafor) l’únic fàrmac en el mercat. En aquest context, el nostre grup ha desenvolupat nanopartícules proteiques basades en el pèptid T22, un lligant de CXCR4, per al lliurament selectiu de dominis citotòxics a les cèl·lules tumorals amb sobreexpressió de CXCR4. L’objectiu de la present tesi doctoral és estudiar el potencial d’aquestes nanopartícules basades en el pèptid T22 per al tractament del CECC. En primer lloc, en aquest treball es demostra que el nanotransportador basat en T22 internalitza de manera selectiva en les cèl·lules tumorals de CECC CXCR4+. A més, aquest nanotransportador també presenta una acumulació en tumor dependent de CXCR4 in vivo, amb una biodistribució menyspreable en altres òrgans. D’altra banda, aquestes nanopartícules basades en el pèptid T22 presenten una gran versatilitat, permetent incorporar dominis peptídics citotòxics per a generar nanopartícules terapèutiques. Seguint aquesta estratègia, hem desenvolupat prèviament les nanotoxines T22-PE24-H6 i T22-DITOX-H6, que incorporen els dominis catalítics de l’exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa i de la toxina diftèrica respectivament. En aquest treball, es demostra que totes dues nanotoxines presenten un efecte citotòxic dependent de CXCR4 en cèl·lules tumorals de CECC. Cal destacar que es descriu per primera vegada la capacitat de totes dues nanotoxinas d’activar la piroptosi mediada per caspasa-3/GSDME, un tipus de mort cel·lular programada proinflamatòria, alternatiu a l’apoptosi. Aquest efecte citotòxic es tradueix en un potent efecte antitumoral in vivo, especialment en el cas de T22-DITOX-H6 que pràcticament frena el creixement tumoral, en absència de toxicitat en altres òrgans. Finalment, el tractament amb T22-DITOX-H6 és capaç de bloquejar la disseminació metastàtica als ganglis limfàtics cervicals, pulmons i fetge sense provocar alteracions histopatològiques en un model murí ortotòpic que reprodueix el patró de metàstasi dels pacients de CECC. En resum, en la present tesi doctoral vam demostrat que les nanotoxines que incorporen el lligand T22 són capaces d’induir piroptosi en cèl·lules tumorals CXCR4+, un mecanisme de mort cel·lular alternatiu a l’apoptosi amb un gran potencial per a millorar el tractament dels pacients amb CECC metastàtic.

El carcinoma escamoso de cabeza y cuello (CECC) representa el séptimo cáncer más común en el mundo, con más de 850.000 nuevos casos y 400.000 muertes en 2020. El tratamiento actual, que incluye una combinación de cirugía, quimioterapia y radioterapia, consigue un control loco-regional de la enfermedad. Sin embargo, los pacientes de CECC continúan en riesgo de desarrollar recidivas loco-regionales y metástasis a distancia, afectando de forma dramática a su pronóstico y supervivencia. A pesar de que el tratamiento para pacientes con recidivas y/o metástasis ha mejorado en los últimos años gracias a la incorporación de anticuerpos monoclonales e inmunoterapia, hasta un 30-40% de los pacientes de CECC mueren a consecuencia de la enfermedad, poniendo de manifiesto la necesidad de nuevas terapias. En los últimos años, el receptor de quimiocinas 4 (CXCR4) ha sido propuesto como una prometedora diana terapéutica. CXCR4 se encuentra sobreexpresado en más de 20 tipos de cánceres, entre ellos el CECC, y esta sobreexpresión ha sido relacionada con una mayor proliferación, angiogénesis, invasión y diseminación metastática. De forma importante, la sobreexpresión de CXCR4 en tumores primarios de CECC está asociada con el desarrollo de recidivas loco-regionales, metástasis y un peor pronóstico de los pacientes. En consecuencia, distintas terapias dirigidas a CXCR4 han sido desarrolladas en las últimas décadas, principalmente inhibidores de CXCR4, siendo el antagonista de CXCR4 AMD3100 (plerixafor) el único fármaco en el mercado. En este contexto, nuestro grupo ha desarrollado nanopartículas proteicas basadas en el péptido T22, un ligando de CXCR4, para la entrega selectiva de dominios citotóxicos a las células tumorales con sobreexpresión de CXCR4. El objetivo de la presente tesis doctoral es estudiar el potencial de estas nanopartículas basadas en el péptido T22 para el tratamiento del CECC. En primer lugar, en este trabajo se demuestra que el nanotransportador basado en T22 internaliza de forma selectiva en las células tumorales de CECC CXCR4+. Además, este nanotransportador también presenta una acumulación en tumor dependiente de CXCR4 in vivo, con una biodistribución despreciable en otros órganos. Por otro lado, estas nanopartículas basadas en el péptido T22 presentan una gran versatilidad, permitiendo incorporar dominios peptídicos citotóxicos para generar nanopartículas terapéuticas. Siguiendo esta estrategia, hemos desarrollado previamente las nanotoxinas T22-PE24-H6 y T22-DITOX-H6, que incorporan los dominios catalíticos de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa y de la toxina diftérica respectivamente. En este trabajo, se demuestra que ambas nanotoxinas presentan un efecto citotóxico dependiente de CXCR4 en células tumorales de CECC. Cabe destacar que se describe por primera vez la capacidad de ambas nanotoxinas de activar la piroptosis mediada por caspasa-3/GSDME, un tipo de muerte celular programada proinflamatoria, alternativa a la apoptosis. Este efecto citotóxico se traduce en un potente efecto antitumoral in vivo, especialmente en el caso de T22-DITOX-H6 que prácticamente frena el crecimiento tumoral, en ausencia de toxicidad en otros órganos. Por último, el tratamiento con T22-DITOX-H6 es capaz de bloquear la diseminación metastática a los ganglios linfáticos cervicales, pulmones e hígado sin provocar alteraciones histopatológicas en un modelo murino ortotópico que reproduce el patrón de metástasis de los pacientes de CECC. En resumen, en la presente tesis doctoral demostramos que las nanotoxinas que incorporan el ligando T22, son capaces de inducir piroptosis en células tumorales CXCR4+, un mecanismo de muerte celular alternativo a la apoptosis con un gran potencial para mejorar el tratamiento de los pacientes con CECC metastásico.

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) represents the seventh most common cancer worldwide, with more than 850,000 new cases and 400,000 deaths in 2020. Current treatment, consisting of a combination of surgery, chemotherapy, and radiotherapy, achieves loco-regional control of the disease. However, these patients are still at risk of developing loco-regional recurrence and distant metastasis, dramatically affecting their prognosis and survival. Although the treatment for recurrent and/or metastatic patients has recently improved with the addition of targeted monoclonal antibodies and immunotherapy, up to 30%‒40% of HNSCC patients still die because of the disease, highlighting the urge for novel therapeutic strategies. In the last years, the chemokine receptor 4 (CXCR4) has emerged as a promising molecular target. CXCR4 is overexpressed in more than 20 cancer types, including HNSCC, and its overexpression has been related to enhanced proliferation, angiogenesis, invasion, and metastasis. Remarkably, CXCR4 overexpression in HNSCC primary tumors associates with loco-regional recurrence, distant metastasis, and worse patient prognosis. Consequently, different CXCR4-targeted anticancer therapies have been developed in the last decades, mainly CXCR4 inhibitors, being the antagonist AMD3100 (plerixafor) the only one in the market. In this context, our group has developed the T22-based protein nanoparticle platform, that incorporates the CXCR4 ligand T22 cationic peptide, for the selective delivery of cytotoxic domains to CXCR4-overexpressing cancer cells. The aim of the present thesis is to study the suitability of these T22-based nanoparticles for the treatment of HNSCC. First, we demonstrate that the T22-nanocarrier selectively internalizes in CXCR4+ HNSCC cancer cells. Consequently, the nanocarrier displays a CXCR4-dependent tumor accumulation in vivo, with negligible biodistribution to non-tumor bearing organs. In addition, this nanoparticle platform presents a great versatility allowing the incorporation of cytotoxic peptidic domains to generate therapeutic nanoparticles. Following this strategy, we have previously developed T22-PE24-H6 and T22-DITOX-H6, that incorporate the toxin catalytic domain of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A and the diphtheria toxin domain, respectively. In the present work, we demonstrate that both nanotoxins exhibit a CXCR4-dependent cytotoxic effect in HNSCC cancer cells. Remarkably, we describe for the first time that both nanotoxins trigger caspase-3/GSDME-dependent pyroptosis, a pro-inflammatory type of programmed cell death alternative to apoptosis. This cytotoxic effect translates into a potent antitumor effect in vivo, especially in the case of T22-DITOX-H6 that practically arrests tumor growth, in the absence of toxicity in other healthy organs. Lastly, T22-DITOX-H6 treatment is capable of effectively blocking metastatic dissemination to the cervical lymph nodes, lungs, and liver in the absence of histopathological alterations in an orthotopic mouse model that replicates the metastatic pattern of HNSCC patients. Overall, in the present thesis we demonstrate that the T22-based nanoparticles, that incorporate toxin domains, induce pyroptosis in CXCR4+ cancer cells, a cell death mechanism alternative to apoptosis with a great potential to improve the treatment of patients with metastatic HNSCC.