Proteína inmunodominante P116 del patógeno humano Mycoplasma pneumoniae: un recipiente para el colesterol y otros lípidos esenciales

Abstract

[spa] Mycoplasma pneumoniaees una bacteria patógena humana sin pared celular que causa neumonías atípicas y otras infecciones respiratorias. Es una de las pocas especies de procariotas que necesitan lípidos en la integridad de su membrana citoplasmática, los cuales debe captar del medio o de la célula hospedadora debido a que en su genoma no tiene los mecanismos para sintetizarlos. En este proyecto hemos caracterizado la proteína P116 de membrana y altamente inmunogénica, que además es esencial para la supervivencia de las células de M.pneumoniae. A partir de criomicroscopía electrónica(Crio-EM)de partícula única (single particle) se reveló una organización homodimérica para los ectodominios de esta proteína. Cada subunidad consta de un dominio distal N-terminal y un dominio central de dimerización presentando un nuevo plegamiento y estructura bastante novedosa. Una de las características más notables del dominio central de la estructura es una gran cavidad con una superficie interna accesible al solvente, pero completamente hidrófoba. Los aminoácidos que recubren la cavidad están altamente conservados entre las proteínas ortólogas en el clúster taxonómico de M.pneumoniae, lo que indica la importancia de la conservación de esta estructura en especies muy emparentadas. En el interior de esta cavidad hidrofóbica se encontró una densidad adicional intensa en el mapa de la Crio-EM,indicandoque esta cavidad está llena de moléculas en forma de cadena, lo que explica el exceso de masa (alrededor de 13kDa) determinado para P116 en estas muestras. Mediante técnicas de análisis molecular cualitativo se determinaron las sustancias que aparecían en la densidad extra del mapa: la espectrometría de masas demostró la presencia de los lípidos esenciales de M.pneumoniae, fosfatidilcolina y esfingomielina, unidos a la P116. Las subunidades de P116 vacías se obtuvieron mediante desnaturalización y reconstitución después de un riguroso tratamiento con detergente. Además, se comprobó mediante marcación de colesterol con tritio radiactivo, como tanto colesterol libre como colesterol esterificado incorporado en lipoproteínas de alta densidad (HDL) humanas,se transfiere a P116 cuando se incuban juntas. La microscopía de fluorescencia con anticuerpos policlonales y monoclonales generados contra el ectodominio de P116, muestra una distribución ubicua de la proteína sobre toda la superficie del micoplasma.Además, en ensayos de inhibición de adherencia se comprobó que la P116 no tiene un papel relevante en la misma, lo que contrasta con la bibliografía. Los constructos de P116 que carecen del dominio N-terminal, al expresarse también resultan en dímeros que, en esta ocasión, muestran una reducción del 50% en el reconocimiento antigénico por el suero de pacientes infectados por M.pneumoniae. Lo que indica que el dominio N-terminal es altamente inmunogénico y, a pesar de su pequeño tamaño comparado con el dominio central, concentra la mitad de epítopos. Los resultados reflejados en esta tesis muestranque P116 tiene un papel esencial en la captura y almacenamiento de moléculas lipídicas del ambiente del hospedador para la organización estructural de la membrana y propósitosmetabólicos de M.pneumoniae.

[eng] P116 is an essential protein for Mycoplasma pneumoniae, a human pathogen responsible for approximately 30% of community-acquired human pneumonia. M pneumoniae needs to uptake lipids from the environment, a characteristic shared by many important human pathogens. How this uptake is accomplished on a molecular level is largely unknown, and there are no comprehensive characterizations of proteins directly involved in this process. Here, we report a comprehensive analysis of P116 by several techniques. Fluorescence microscopy, using antibodies raised against the ectodomain of P116, shows a ubiquitous distribution of P116 on the cell surface. Single-particle cryo-electron microscopy at 3.3 Å resolution reveals two homodimers connected by a dimerization interface, and a core domain presenting a previously unseen fold. This fold creates a large cavity of ~38 Å by 62 Å with a fully hydrophobic internal surface that is accessible to solvent. The hydrophobic residues lining the cavity are conserved in P116 orthologues of other mycoplasma species. Elongated densities of ~8 Å by 30 Å within the cavity, which are not accounted for by the structure, are identified by mass spectrometry as the essential lipids phosphatidylcholine and sphingomyelin. When the cavity is emptied by stringent treatment with detergents, it undergoes an extensive conformational change to adopt a closed conformation that does not allow for the accommodation of lipids. A radioactivity transfer experiment demonstrates a net transfer of cholesterol from high- density lipoproteins (HDLs) to P116, and cryo-electron microscopy shows a direct attachment of P116 to HDLs. The results show the mechanism by which P116 captures essential lipids from the host environment that are required for metabolic purposes and delivers them by a wringing movement into the membrane by passive transport.