Evaluation of immunebiomarkers in Lung Cancer

Abstract

[eng] Treatment landscape in early-stage NSCLC is rapidly changing after approval of anti-PD-1/PD-L1 in the neoadjuvant and adjuvant settings, respectively. However, biomarkers for patient selection, to predict response and to inform immunotherapeutic resistance are not available. Here we interrogate the expression patterns of CD73 in malignant cells and examined host anti-tumor immune response in order to describe and elucidate potential tumor mechanisms that promote immune evasion. We also assess immune biomarkers in early stage NSCLC surgical specimens. Finally, we evaluate immune features that promote response after chemotherapy or chemoimmunotherapy treatment, with the aim to uncover immune predictive and prognostic biomarkers in early-stage lung cancer.

Our results pointed to the potential role of CD73, and other members of the adenosine signaling pathway, as potential mechanisms of tumor immune evasion and resistance to ICI, thus providing additional rationale for propagating anti-CD73 antibodies in new combinatorial immunotherapeutic regimens. We found that CD73 expression was significantly and progressively increased across normal-appearing lung tissue, adenomatous atypical hyperplasia, adenocarcinoma in situ, minimally invasive adenocarcinoma, and lung adenocarcinoma (LUAD). We observed that differential CD73 localization was associated with distinct clinicopathological and molecular features in LUAD. CD73 expression was positively associated with an increase in PD-L1 expression in tumor cells and increase of tumor-associated immune cells. Additionally, and using targeted gene sequencing analysis and immunohistochemistry, we characterized immune programs across patients that underwent upfront surgery, neoadjuvant chemotherapy, or neoadjuvant chemoimmunotherapy. We identified immune gene programs that are unique to PD-L1 positive and PD-L1 negative NSCLCs as well as those that are shared between both groups. Using IHC, we observed that PD-L1 positive (≥1%) LUADs exhibited an augmented infiltration of T cells (CD3+, CD4+, CD8+ cells) along with increase of FOXP3+ cells, resident memory cells (CD103+) and macrophages (CD68+). Spatial distribution of CD8+ T cells unveiled distinctive TIME phenotypes whose frequencies differed based on TNM stage, PD-L1 expression, and mutational burden. Inflamed and PD-L1+/TILs+ NSCLCs displayed significantly amplified lev- els of immune signatures, with the excluded group representing an intermediate immune state. Subgroup analysis based on the expression of tumor PD-L1, and resident memory immune cells (CD103+ cells) showed an enrichment of immune cell infiltrates (CD3+, CD4+, CD8+, CD68+ cells) in tumors harboring higher levels of CD103+ immune cells along with an increase of CD80+ cells, essential for T cell activation. Longitudinal analysis of patients following neoadjuvant chemoimmunotherapy showed strong upregulation of immune cells signatures within the TIME. In this cohort, pathologic response to chemoimmunotherapy was positively associated with higher expression of genes involved in immune activation, chemotaxis, as well as T and natural killer cells. Comparative analysis between the three cohorts, underscored immune programs and signatures that overall were progressively modulated along the spectrum of treatment-naïve, neoadjuvant chemotherapy-treated, up to those treated with chemoimmunotherapy, pointing to an association between perturbation of an expanded repertoire of immune gene sets with neoadjuvant chemoimmunotherapy.

In conclusion, our findings suggest that higher CD73 expression is associated with an overall augmented host immune response, suggesting potential implications in the immune pathobiology of early-stage lung adenocarcinoma. Additionally, our results highlight immune gene programs and IHC markers that may underlie host tumor immunity and response to neoadjuvant chemotherapy and chemoimmunotherapy in resectable NSCLC.

[spa] El escenario del tratamiento del cáncer de pulmón en estadios localizados está cambiando rápidamente después de la aprobación de anti-PD-1/PD-L1 como tratamiento neoadyuvante o adyuvante, respectivamente. Sin embargo, no disponemos de biomarcadores para la selección de pacientes que ayuden a predecir la respuesta y para informar la resistencia a la inmunoterapia. En este trabajo, evaluamos los patrones de expresión de CD73 en las células malignas, así como la respuesta inmunitaria antitumoral del huésped con el objetivo de describir y dilucidar algunos de los mecanismos tumorales que promueven la evasión inmunitaria, así como las características inmunitarias que desencadenan la respuesta después del tratamiento con quimioterapia o quimioinmunoterapia, con el objetivo de revelar biomarcadores inmunes en el cáncer de pulmón en etapa temprana.

Nuestros resultados señalan el papel de CD73 y otros miembros de la vía de señalización de la adenosina como mecanismos potenciales de evasión inmune por parte de los tumores y de resistencia a la inmunoterapia, proporcionando una justificación adicional para el desarrollo de anticuerpos anti-CD73 en combinación con inmunoterapia. Además, encontramos que la expresión de CD73 aumenta significativa y progresivamente a lo largo de tejido pulmonar de apariencia normal, hiperplasia atípica adenomatosa, adenocarcinoma in situ, adenocarcinoma mínimamente invasivo y, finalmente, adenocarcinoma de pulmón. Observamos también que la localización diferencial de CD73 se asocia con distintas características clinicopatológicas y moleculares en adenocarcinomas de pulmón. La expresión de CD73 se asocia positivamente con un aumento en la expresión de PD-L1 en células tumorales y un aumento de células inmunitarias intratumorales.

Además, mediante el uso de análisis de secuenciación de genes específicos y por inmunohistoquímica (IHC), caracterizamos los perfiles inmunes en pacientes que se sometieron a cirugía, quimioterapia neoadyuvante o quimioinmunoterapia neoadyuvante. Identificamos perfiles de genes inmunitarios que son exclusivos de tumores PD-L1 positivos y PD-L1 negativos, así como los que comparten ambos grupos. Usando IHC, observamos que los adenocarcinomas de pulmón positivos para PD-L1 (≥1%) exhiben una infiltración aumentada de células T (células CD3+, CD4+, CD8+) junto con un aumento de células FOXP3+, células de memoria residentes (CD103+) y macrófagos (CD68+). La distribución espacial de las células T CD8+ revela distintos fenotipos de microambientes tumorales cuyas frecuencias difieren según el estadio TNM, la expresión de PD-L1 y la carga mutacional. Los tumores inflamados y PD-L1+/TILs+ muestran niveles significativamente aumentados de marcadores inmunes, mientras que el fenotipo excluido representa un estado inmunitario intermedio. El análisis de subgrupos basado en la expresión tumoral de PD-L1 y la presencia de células inmunitarias de memoria residentes (células CD103+) muestra un enriquecimiento de infiltrados de células inmunitarias (células CD3+, CD4+, CD8+, CD68+) en tumores que albergan niveles elevados de células inmunitarias CD103+ junto con un aumento de células CD80+, esenciales para la activación de los linfocitos T. El análisis longitudinal de los pacientes después de quimioinmunoterapia neoadyuvante muestra un aumento de los marcadores inmunes intratumorales. En esta cohorte, la respuesta patológica a la quimioinmunoterapia se asocia positivamente con una mayor expresión de genes implicados en la activación inmune, la quimiotaxis, así como genes característicos de células T y células natural killer. El análisis comparativo entre las tres cohortes subraya los perfiles inmunes que, en general, se modulan progresivamente a lo largo del espectro de los pacientes tratados con cirugía de entrada, quimioterapia neoadyuvante, hasta los tratados con quimioinmunoterapia, lo que señala el papel de la quimioinmunoterapia neoadyuvante como desencadenante de una respuesta inmunitaria antitumoral.

En conclusión, nuestros hallazgos sugieren que una mayor expresión de CD73 se asocia con una respuesta inmune aumentada, con potenciales implicaciones en la patobiología inmune de los adenocarcinomas de pulmón en estadio iniciales. Además, nuestros resultados destacan perfiles de genes inmunitarios y marcadores por IHC que caracterizan la inmunidad anti-tumoral del huésped y de respuesta a tratamientos con quimioterapia o quimioinmunoterapia neoadyuvantes en el cáncer de pulmón resecable.