Development and application of in-vitro assays for the study of the biological activity of pharmaceutical products

Abstract

[eng] This industrial Ph.D. thesis aimed to illustrate the presence of the cell-based bioassays throughout the whole life of a drug product and to demonstrate its importance for a complete characterization of a pharmaceutical product, ensuring its quality, effectiveness, and safety. To do so, the assays performed for the analysis of three different products under study in Reig Jofre were analysed to illustrate the importance of this assays to guarantee the obtention of high- quality products in the pharmaceutical industry.

In the first place, the candidates to be used as active ingredients for a cream to treat acne outbreaks were analysed. The first step taken was to characterize the impact of an infection produced by heat inactivated Cutibacterium acnes, associated with acne, in the HaCaT cell line. To do so, the modification of the expression of the toll like receptors 2 and 4, and the inflammatory response caused in response to the activation of these two receptors in the infection, were evaluated. After that, the anti-inflammatory capacity of a Camellia sinensis plant extract, a Morinda citrifolia plant extract and a combination of both, achieving a reduction of the inflammatory response caused by Cutibacterium acnes, was illustrated.

In the second place, different analysis for the demonstration of biosimilarity and for the evaluation of the potency of a new thrombopoietin receptor agonist biosimilar, under development at Reig Jofre, for the treatment of immune thrombocytopenia were performed. The first thing done was to demonstrate equivalent receptor binding between the reference material product and the biosimilar to the thrombopoietin receptor, using a biacore analysis. The second step performed was to develop two assays for the evaluation of the potency of the thrombopoietin receptor agonist biosimilar based on two modified cell lines to overexpress in their membranes the thrombopoietin receptor. All the assays performed for the demonstration of the adequate responsiveness of the cell line to the stimulation with the biosimilar, the steps taken for the optimization process of the two bioassays and the validation exercises for the demonstration of adequate linearity, precision, accuracy, selectivity, and robustness of the two developed assays are presented in this industrial Ph.D. thesis. The bioassays developed have been used for the demonstration of biosimilarity of the new Reig Jofre product, for the demonstration of batch-to-batch equivalency and of the stability of the product and for the evaluation of the impact of manufacturing modifications in the final product obtained.

Finally, the cytotoxicity produced by a cream for scabies treatment, based on disulfiram and benzyl benzoate as active ingredients, which is already in the marked, was characterized, illustrating the importance of continuing evaluating the products after their launching to the

marked to gain new information, which may be useful to find new possibilities for the product. For the characterization of the cytotoxicity occurring after the application of the treatment, a cytotoxicity assay was performed to evaluate the effect of the different cream components on HEK001, a keratinocytes cell line, and, after that, a microarray analysis was performed to provided information on the cellular signalling pathways affected after the 24 h treatment with the cream. Altogether, the analysis presented for the evaluation of different drug products’ biological activities at different stages of the drug development process illustrate the essentiality of this kind of assays to ensure the production of high-quality products for patients’ treatment.

[spa] El objetivo de este proyecto de doctorado industrial consistía en demostrar la importancia de los ensayos basados en células durante toda la vida de un producto farmacéutico, debido a su importancia para una completa caracterización de los productos, asegurando su calidad, eficacia y seguridad. A para ello, los ensayos realizados para el análisis de tres productos que se encuentran en diferentes etapas del desarrollo en Reig Jofre fueron analizados.

En primer lugar, se analizaron diferentes candidatos a ser utilizados como principios activos de una crema en desarrollo para el tratamiento del acne. Primeramente, se caracterizó el efecto en células HaCaT de una infección con Cutibacterium acnes inactivado por calor, a través de la evaluación de la modificación de la expresión de los receptores toll like 2 y 4, y de la respuesta inflamatoria causada en respuesta a la activación de estos dos receptores. Después de esto, se evaluó la capacidad antiinflamatoria de los extractos vegetales de Camellia sinensis y de Morinda citrifolia, y de una combinación de ambos, demostrando que con las opciones se observaba una reducción de la respuesta inflamatoria provocada por Cutibacterium acnes.

En segundo lugar, se desarrollaron diferentes análisis para la demostración de la biosimilitud y para la evaluación de la potencia de un nuevo biosimilar en desarrollo en Reig Jofre, el cual actúa como agonista del receptor de trombopoyetina. Lo primero que se hizo fue demostrar una unión al receptor de la trombopoyetina equivalente entre el producto de referencia y el biosimilar, utilizando un análisis por biacore. El segundo paso realizado fue desarrollar dos ensayos para la evaluación de la potencia del biosimilar basados en dos líneas celulares modificadas para la sobreexpresión en sus membranas el receptor de trombopoyetina. Todos los ensayos realizados para la demostración de la adecuada capacidad de respuesta de la línea celular a la estimulación con el biosimilar, los pasos tomados para el proceso de optimización de los dos bioensayos y los ejercicios de validación para la demostración de linealidad, precisión, exactitud, selectividad y robustez adecuadas de los dos Los ensayos desarrollados se presentan en esta tesis de doctorado industrial.

Finalmente, se caracterizó la citotoxicidad que produce una crema para el tratamiento de la sarna, ya comercializada, a base de disulfiram y benzoato de bencilo como ingredientes activos, ilustrando la importancia de continuar evaluando los productos luego de su lanzamiento al mercado marcados para obtener nueva información, que puede ser útil para encontrar nuevas posibilidades para el producto. Para la caracterización de la citotoxicidad que se produce tras la aplicación del tratamiento, se realizó un ensayo de citotoxicidad para evaluar el efecto de los diferentes componentes de la crema, por separado, en HEK001 y, posteriormente, se realizó un análisis de microarrays para proporcionó información sobre las vías de señalización celular afectadas después de un tratamiento de 24 h con la crema.

En conjunto, los análisis presentados para la evaluación de la actividad biológica de diferentes productos farmacéuticos los cuales se encuentran en diferentes etapas del proceso de desarrollo farmacéutico ilustran la esencialidad de este tipo de ensayos para garantizar la producción de productos de alta calidad para el tratamiento de los pacientes.