Exploring approaches and biotechnological tools to better characterize sweet potato viruses

Abstract

Les malalties virals plantegen un gran repte per a una producció agrícola sostenible. El moniato (Ipomoea batatas) és un dels cultius més importants a nivell mundial i la seva producció està amenaçada per molts virus que poden limitar-ne el rendiment i la qualitat, especialment quan es troben en infeccions mixtes. La gran diversitat de virus que poden estar presents simultàniament al moniato crea patosistemes complexos que requereixen d'estudis detallats per tal de millorar les estratègies de control contra aquestes malalties virals. Aquesta tesi aborda la caracterització de certs aspectes biològics de quatre virus de moniato, incloent els potyvirus Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV) i Sweet potato virus 2 (SPV2), transmesos per àfids, així com l'ipomovirus Sweet potato mild mottle virus (SPMMV) i el crinivirus Sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV), transmesos per mosca blanca. Al primer capítol, comparem la variabilitat natural entre dos aïllats de SPMMV, el 130 i el 0900, en dos hostes experimentals, amb especial atenció a la simptomatologia de la malaltia i l'acumulació viral en plantes amb infeccions simples i mixtes. A més, fem comparacions de seqüències entre els dos aïllats per tal de detectar diferències que poguessin explicar la divergència de símptomes observats en plantes de N. tabacum i d' I. nil. També explorem hostes comuns entre SPMMV i SPCSV per a l'estudi de les coinfeccions, i identifiquem noves plantes susceptibles a la infecció per SPCSV, ampliant encara més el seu rang d'hostes coneguts. Al capítol segon, identifiquem i caracteritzem productes gènics de SPV2 que confereixen activitat supressora del silenciament d'ARN (RSS). Es va analitzar l'activitat RSS de diferents productes gènics ubicats a la regió 5' del genoma viral, emprant assajos de coagroinfiltració en plantes de N. benthamiana amb la proteïna GFP com a indicadora. Els resultats visuals sota llum UV van revelar que els diferents productes gènics exhibien activitat supressora. Aquests resultats van ser confirmats mitjançant q-RT-PCR i Northern blot, tècniques que permeten mesurar els nivells d'ARNm corresponents a la GFP. A més, es va examinar si aquestes proteïnes interferien amb el senyal de silenciament d'ARN durant el moviment sistèmic. D'altra banda, també es va avaluar la capacitat RSS de les proteïnes de SPV2 durant infeccions virals utilitzant un vector d'expressió heteròleg. Finalment, amb l'objectiu d'obtenir més informació sobre els mecanismes moleculars necessaris per a l'especificitat dels insectes vectors, i sobre la disseminació de virus de moniato mediada per aquests, durant el capítol tercer es van dur a terme estudis estructurals basats en la producció de partícules similars a virus (VLPs) en plantes. Les VLPs de SPFMV, SPV2 i SPMMV es van produir a través de l'expressió transitòria de les seves proteïnes CP corresponents a N. benthamiana, utilitzant un vector d'expressió autoreplicatiu. Assajos de Western Blot i imatges de microscòpia electrònica (EM) d'extractes crus de fulles infiltrades, van confirmar la sobreexpressió de les CP i el seu acoblament posterior en VLPs que s'assemblaven als filaments flexuosos dels virus originals. Les VLPs es van purificar i es van fer servir per a estudis de crio-microscòpia electrònica (cryo-EM), permetent-nos resoldre la seva estructura amb una resolució gairebé atòmica. Els nostres resultats ofereixen més informació sobre la variabilitat dels determinants moleculars utilitzats pels membres de la família Potyviridae per fer front a les defenses de l'hoste. A més, els resultats van permetre la comparació de les estructures de partícules corresponents a un potyvirus i un ipomovirus que poden infectar la mateixa planta hoste però que són transmesos per diferents insectes vectors, proporcionant la base per a futurs estudis per comprendre millor les seves propietats biològiques i que esperem que serveixen per a dissenyar mesures de control efectives.

Las enfermedades virales plantean un gran desafío para una producción agrícola sostenible. La batata (Ipomoea batatas) es uno de los cultivos más importantes del mundo y su producción está amenazada por muchos virus que pueden limitar su rendimiento y calidad, especialmente cuando aparecen en infecciones mixtas. La gran diversidad de virus que pueden estar presentes simultáneamente en batata crea patosistemas complejos que requieren estudios detallados para mejorar las estrategias de control contra estas enfermedades virales. La presente tesis aborda la caracterización de ciertos aspectos biológicos de cuatro virus de batata, incluidos los potyvirus Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV) y Sweet potato virus 2 (SPV2), transmitidos por áfidos, y el ipomovirus Sweet potato mild mottle virus (SPMMV) y el crinivirus Sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV), transmitidos por mosca blanca. En el primer capítulo, comparamos la variabilidad natural entre dos aislados de SPMMV, el 130 y el 0900, en dos huéspedes experimentales, con especial atención en la sintomatología de la enfermedad y la acumulación viral en plantas con infección simple y mixta a lo largo del tiempo. Además, realizamos comparaciones de secuencias entre los dos aislados para detectar diferencias que pudieran explicar la divergencia de síntomas observados en plantas de N. tabacum e I. nil. También exploramos huéspedes comunes entre SPMMV y SPCSV para el estudio de sus coinfecciones e identificamos nuevas plantas susceptibles a la infección por SPCSV, ampliando aún más su rango de huéspedes conocidos. En el segundo capítulo, identificamos y caracterizamos productos génicos del virus SPV2 que confieren actividad supresora de silenciamiento de ARN (RSS). Se analizó la actividad RSS de diferentes productos génicos ubicados en la región 5' del genoma viral, empleando ensayos de co-agroinfiltración con una proteína indicadora GFP en plantas de N. benthamiana. Los resultados revelaron que diferentes productos génicos presentaban actividad supresora. Nuestros hallazgos fueron confirmados por q-RT-PCR y transferencia Northern midiendo los niveles de ARNm de GFP. Además, examinamos si estas proteínas interferían con la señal de silenciamiento de ARN en el movimiento sistémico. Por último, también se evaluó la capacidad RSS de las proteínas de SPV2 durante infecciones virales utilizando un vector de expresión heterólogo. Finalmente, y con el objetivo de obtener información sobre los mecanismos moleculares requeridos para la especificidad de vector en la transmisión mediada por insectos de virus de batata, en el tercer capítulo realizamos estudios estructurales basados en la producción de partículas similares a virus (VLPs) en plantas. Las VLPs de SPFMV, SPV2 y SPMMV se produjeron a través de expresión transitoria de sus respectivas proteínas de cápside (CP) en N. benthamiana, utilizando un vector de expresión auto-replicativo. La transferencia Western y las imágenes de microscopía electrónica (EM) de extractos crudos de hojas infiltradas confirmaron la sobreexpresión de las tres CPs y su posterior ensamblaje en VLPs que se asemejan a los filamentos flexuosos de los virus originales. Las VLPs se purificaron y se usaron para estudios de criomicroscopía electrónica (cryo-EM), lo cual nos permitió resolver su estructura con una resolución casi atómica. En general, nuestros resultados brindan una mayor información sobre la variabilidad de los determinantes moleculares utilizados por los miembros de la familia Potyviridae para hacer frente a las defensas del huésped, lo que revela un escenario evolutivo complejo en el caso de los potyvirus de batata. Además, permitieron la comparación de las estructuras de partículas correspondientes a un potyvirus y un ipomovirus que pueden infectar la misma planta huésped pero que son transmitidos por diferentes insectos vectores, proporcionando la base para futuros estudios que ayuden a comprender mejor sus propiedades biológicas, y que esperamos sirvan para diseñar medidas de control efectivas y duraderas.

Viral diseases pose a major challenge to sustainable agriculture. Sweet potato (Ipomoea batatas) is one of the most important staple crops worldwide and its production is threatened by many pathogenic viruses which can limit yield and quality, especially when found in mixed infections. The high diversity of viruses that can be present simultaneously in sweet potato plants creates complex pathosystems that require detailed studies for the improvement of control strategies against viral diseases. The present thesis addresses the characterization of important biological aspects of four widespread sweet potato viruses, including the aphid transmitted potyviruses Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV) and Sweet potato virus 2 (SPV2) and the whitefly transmitted ipomovirus Sweet potato mild mottle virus (SPMMV) and crinivirus Sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV). In the first chapter of the dissertation, we compared the natural variability between two isolates of SPMMV, the 130 and the 0900, in two experimental hosts, with special attention to disease symptomatology and viral accumulation in single and mixed infected plants over time. Moreover, we performed sequence comparisons between the two isolates to detect differences that could account for the symptom divergence observed in both N. tabacum and I. nil plants. Additionally, we explored common hosts between SPMMV and SPCSV for the study of their co-infections and identified novel plants susceptible to SPCSV infection, further expanding its known host range. In the second chapter, we identified and characterized gene products that confer RNA silencing suppressor (RSS) activity in the case of SPV2. Different gene products located at the viral 5´end region of the genome were tested for RSS activity employing co-agroinfiltration assays with a GFP reporter in N. benthamiana plants. Visual results under UV revealed that different gene products exhibited RSS activity. Our findings were confirmed by q-RT-PCR and Northern blotting measuring GFP mRNA levels. Additionally, we examined whether these viral proteins were interfering with the systemic movement of the RNA silencing signal. Last, the RSS capacity of SPV2 proteins were also assessed during viral infections using a heterologous expression vector. Finally, and aiming to gain insights on the molecular mechanisms required for vector specificity and vector-mediated dissemination of sweet potato viruses, in the third chapter, we conducted structural studies based on the production of flexuous virus-like particles (VLPs) in plants, a system with a great potential for nanobiotechnological uses. VLPs of SPFMV, SPV2 and SPMMV were produced through transient expression of their respective CPs in N. benthamiana plants, using a self-replicating expression vector. Western blotting with specific antibodies and electron microscopy (EM) imaging of crude extracts of infiltrated leaves confirmed overexpression of CPs and their subsequent assembly into VLPs that resemble the flexuous filaments of the corresponding viruses. The VLPs were purified and used for cryo-EM studies, allowing us to solve their structure at near-atomic resolution. Overall, our results provide further insights about the variability of molecular determinants used by potyvirids to cope with host defenses, revealing a complex evolutionary scenario in the case of sweet potato potyviruses. Moreover, they allowed comparison of the structures of particles corresponding to a potyvirus and an ipomovirus that are able to infect the same host plant but are disseminated by different insect vectors, providing the basis for future studies to better understand their biological properties, and hopefully to design effective and durable control measures.