Cloning, expression and purification/immobilisation of CBM–tagged enzymes involved in multienzymatic production of lactic acid

Abstract

Aquesta tesi respon a la necessitat de reduir els costos operacionals associats a la producció, a la purificació i a la immobilització de biocatalitzadors emprats en bioprocessos. Per a desenvolupar i validar les diverses estratègies d'intensificació de procés plantejades en el present treball, s'han escollit tres biocatalitzadors —alcohol deshidrogenasa (ADH), piruvat descarboxilasa (PDC) i lactat deshidrogenasa (LDH)— els quals formen part d'un sistema biocatalític proposat dins del projecte europeu BIOCON-CO₂, per a sintetitzar àcid làctic. En aquest context, per tal d'obtenir els biocatalitzadors d'interès de la manera més eficient possible, s'han integrat diversos procediments de diferents camps, incloent mètodes de clonació de gens i processos de producció de proteïnes recombinants amb el bacteri Gram negatiu Escherichia coli, així com el desenvolupament d'un procés d'una única etapa de purificació/immobilització de biocatalitzadors, basat en l'afinitat de dominis proteics d'unió a carbohidrats cap a suports cel·lulòsics de baix cost. En la primera part d'aquesta tesi, es va emprar la soca d'E. coli NEB 10-ß per a l'expressió dels tres enzims implicats en el sistema multienzimàtic proposat per a la síntesi d'àcid làctic amb una cua d'histidines fusionada al seu extrem N-terminal. El procés de producció, basat en el sistema d'expressió PBAD, va demostrar ser exitós no només utilitzant medis de cultiu complexos, sinó també amb medis químicament definits, suplementats amb aminoàcids, seguint una estratègia de cultiu en fed-batch de dos etapes. Tot i així, els tres enzims d'interès es van produir posteriorment utilitzant una soca auxotròfica derivada de la soca M15 a escala de reactor de laboratori mitjançant cultius en fed-batch i amb un medi de cultiu definit lliure d'antibiòtics. D'aquesta manera, la soca M15δglyA va demostrar ser una soca hoste més adequada i més robusta per a la producció en grans quantitats dels enzims necessaris, tot i que la soca NEB 10-ß també va resultar ser un hoste microbià factible. La segona part d'aquesta tesi es va centrar en la generació de noves variants dels enzims que contenien diferents mòduls d'unió a carbohidrats fusionats als respectius extrems N-terminal, amb l'objectiu de desenvolupar un mètode de purificació/immobilització d'una única etapa que permeti recuperar els enzims produïts amb una alta especificitat i eficiència, mitjançant l'ús de suports d'immobilització de cel·lulosa, que no només són econòmics sinó que també permeten evitar la presència de ions metàl·lics, presents habitualment en mostres processades amb resines d'afinitat que contenen metalls quelats. Els tres enzims diana es van coexpressar amb èxit amb dos CBM diferents —un d'ells provinent de la xilanasa 10A de T. maritima (CBM9) i un altre originari de la proteïna estructural A del cel·lulosoma de C. Thermocellum (CBM3)— emprant la soca d'E. coli M15δglyA. Les proteïnes de fusió resultants es van produir amb èxit a altes concentracions en un reactor de laboratori seguint la mateixa estratègia aplicada per produir les variants amb cua d'histidina. Els resultats van mostrar que la soca M15δglyA era capaç de produir amb la mateixa eficiència els enzims fusionats amb els CBM com els fusionats a la cua d'histidines, demostrant-se també que els dominis CBM no tenen un impacte negatiu significatiu en la capacitat catalítica dels enzims. Finalment, es va desenvolupar i caracteritzar el procés de purificació/immobilització d'un sol pas dels enzims fusionats amb els CBM en suports cel·lulòsics de baix cost i d'alta selectivitat, incloent l'estudi de l'estabilitat en condicions d'emmagatzematge dels derivats immobilitzats i la determinació de la capacitat de càrrega màxima dels suports. Els enzims fusionats amb CBM9 van demostrar que s'uneixen eficaçment a la cel·lulosa amorfa regenerada a altes càrregues d'enzim, mentre que els enzims fusionats amb CBM3 es van unir amb una afinitat més alta a la cel·lulosa microcristal·lina.

Esta tesis responde a la necesidad de reducir los costes operacionales asociados a la producción, purificación e inmovilización de biocatalizadores empleados en bioprocesos. Para desarrollar y validar las diversas estrategias de intensificación de proceso planteadas en el presente trabajo, se han escogido tres biocatalizadores -alcohol deshidrogenasa (ADH), piruvato descarboxilasa (PDC) y lactato deshidrogenasa (LDH)- los cuales forman parte de un sistema biocatalítico propuesto dentro del proyecto europeo BIOCON-CO₂, para sintetizar ácido láctico. En este contexto, para obtener los biocatalizadores de interés de la forma más eficiente posible, se han integrado diversos procedimientos de diferentes campos, incluyendo métodos de clonación de genes y procesos de producción de proteínas recombinantes con la bacteria Gram negatiu Escherichia coli, así como el desarrollo de un proceso de una única etapa de purificación/inmovilización de biocatalizadores, basado en la afinidad de dominios proteicos de unión a carbohidratos hacia soportes celulósicos de bajo coste. En la primera parte de esta tesis, se empleó la cepa de E. coli NEB 10-ß para la expresión de las tres enzimas implicadas en el sistema multienzimático propuesto para la síntesis de ácido láctico con una cola de histidinas fusionada en su extremo N-terminal. El proceso de producción, basado en el sistema de expresión PBAD, demostró ser exitoso no sólo utilizando medios de cultivo complejos, sino también con medios químicamente definidos, suplementados con aminoácidos, siguiendo una estrategia de cultivo en fed-batch de dos etapas. Sin embargo, las tres enzimas de interés se produjeron posteriormente utilizando una cepa auxotrófica derivada de la cepa M15 a escala de reactor de laboratorio mediante cultivos en fed-batch y con un medio de cultivo definido libre de antibióticos. De este modo, la cepa M15δglyA demostró ser una cepa huésped más adecuada y más robusta para la producción en grandes cantidades de las enzimas necesarias, aunque la cepa NEB 10-ß también resultó ser un huésped microbiano factible. La segunda parte de esta tesis se centró en la generación de nuevas variantes de las enzimas que contenían diferentes módulos de unión a carbohidratos fusionados en los respectivos extremos N-terminal, con el objetivo de desarrollar un método de purificación/inmovilización de una única etapa que permita recuperar las enzimas producidas con una alta especificidad y eficiencia, mediante el uso de soportes de inmovilización de celulosa, que no sólo son económicos sino que también permiten evitar la presencia de iones metálicos, presentes habitualmente en muestras procesadas con resinas de afinidad que contienen metales quelatos. Las tres enzimas diana se coexpresaron con éxito con dos CBM diferentes —uno de ellos proveniente de la chilanasa 10A de T. maritima (CBM9) y otro originario de la proteína estructural A del celulosoma de C. Thermocellum (CBM3) — empleando la cepa de E. coli M15δglyA. Las proteínas de fusión resultantes se produjeron con éxito en altas concentraciones en un reactor de laboratorio siguiendo la misma estrategia aplicada para producir las variantes con cola de histidina. Los resultados mostraron que la cepa M15δglyA era capaz de producir con la misma eficiencia las enzimas fusionadas con los CBM como las fusionadas en la cola de histidinas, demostrándose también que los dominios CBM no tienen un impacto negativo significativo en la capacidad catalítica de las enzimas. Finalmente, se desarrolló y caracterizó el proceso de purificación/inmovilización de un solo paso de las enzimas fusionadas con los CBM en soportes celulósicos de bajo coste y de alta selectividad, incluyendo el estudio de la estabilidad en condiciones de almacenamiento de los derivados inmovilizados y la determinación de la capacidad de carga máxima de los soportes.

The present thesis responds to the need to reduce the operational costs associated with the production, purification and immobilisation of biocatalysts used in bioprocesses. The process intensification strategies described have been developed and validated for three different enzymes —an alcohol dehydrogenase (ADH), a pyruvate decarboxylase (PDC) and a lactate dehydrogenase (LDH)— which are involved in a biocatalytic system proposed by the European BIOCON-CO₂ project, which aims to synthesize lactic acid. In this context, in order to obtain the biocatalysts of interest in the most efficient way, the integration of several procedures from different fields is attempted, including gene cloning methods and processes for the production of recombinant proteins with the Gram-negative bacterium Escherichia coli, and also with the development of a one-step biocatalyst purification/immobilisation process, based on the affinity of carbohydrate—active protein domains towards low-cost cellulosic supports. In the first part of this thesis, the E. coli strain NEB 10-ß was used for the expression of the three enzymes involved in the multienzyme system proposed to obtain lactic acid synthesis with a histidine tag fused to their N-terminal end. The production process, based on the PBAD expression system, proved to be successful, not only by using complex culture mediums but also with chemically defined medium supplemented with amino acids, used in a two-step fed batch strategy. Nevertheless, aiming to assess if higher production yields could be achieved, the three target enzymes were cloned into an in-house developed expression vector, based on the T5 lac promoter, and were subsequently produced by using one auxotrophic M15-derived strain at bench-scale reactor through fed-batch cultures and antibiotic-free defined culture medium. Thus, M15δglyA strain proved to be a more suitable and more robust E. coli host strain to produce the required enzymes at high titres, although the NEB 10-ß strain also resulted to be a feasible microbial host. The second part of this thesis was focused on the generation of new enzyme variants, containing different Carbohydrate—Binding Modules (CBM) fused to their N-terminal end, aiming to develop a one-step purification/immobilisation method which enables to recover the enzymes produced with high specificity and efficiency, by using cheap immobilisation cellulosic supports while avoiding the presence of metal ions, usually present in samples processed with immobilized—metal affinity resins. The three target enzymes were successfully co-expressed with two different CBMs —one from T. maritima Xylanase 10A (CBM9) and one from C. Thermocellum cellulosomal—scafolding protein A (CBM3)— in E. coli M15δglyA strain. The resulting fusion proteins were successfully produced at high titres in a bench-scale reactor by following the same strategy applied to produce the histidine—tagged variants. Results showed that M15δglyA strain was able to produce CBM—fused enzymes as efficiently as histidine-tagged ones, and it was also proved that CBM domains do not have a significant negative impact in enzyme performance. Finally, it was developed and characterised the one-step purification/immobilisation process of the different CBM—tagged variants onto low-cost and highly selective cellulosic supports, including the study of storage stability of the immobilised derivatives and the determination of maximum loading capacity of the supports. CBM9—fused enzymes proved to bind effectively to regenerated amorphous cellulose (RAC) at high loads, whereas CBM3—tagged enzymes bound with higher affinity onto microcrystalline cellulose (MC). Moreover, RAC support was also used for protein purification by fast liquid protein chromatography (FPLC), aiming to establish an alternative to metal affinity chromatography, by which only CBM9 proved to be a suitable purification tag for the three enzymes tested.