Targeting BRAF mutant pre-mRNA alternative splicing in melanoma

Abstract

Alternative splicing of BRAF mRNA can provide a resistance mechanism to BRAF and MEK inhibitors that has been described mostly in BRAF-mutant melanoma. The mechanisms underlying the production of a variety of BRAF mRNA isoforms, e.g., the BRAF3-9 (which lacks exons 4 to 8), remain poorly understood. Analysis of RNA-seq from melanoma samples identified for the first time BRAF mRNA isoforms associated with resistance in wild type BRAF and in treatment-naïve melanoma samples. Using minigene assays and whole-genome sequencing, we have reasonably rule out a contribution of single-nucleotide sequence variants (such as intronic mutations) in the generation of these isoforms. Using a CRISPR-Cas9 knockout screen, we have identified genetic vulnerabilities related to splicing and chromosome dynamics in melanoma cells, but not splicing factors particularly involved in the generation of BRAF3-9. Importantly, we have identified large intragenic deletions as the underlying mechanism for the production of BRAF3-9 and BRAF1-9 isoforms, suggesting that this can be a general mechanism for the production of resistance-associated mRNA variants in melanoma.

El splicing alternativo del ARNm de BRAF es un mecanismo de resistencia a los inhibidores de BRAF y MEK descrito principalmente en melanomas que presentan mutaciones en BRAF. Los mecanismos moleculares responsables de la producción de las distintas isoformas de ARNm de BRAF descritas no se conocen profundidad. Gracias al análisis de RNA-seq de muestras de melanoma hemos identificado por primera vez isoformas de BRAF que han sido asociadas con la adquisición de resistencia en muestras con BRAF no mutado y que no habían recibido tratamiento. Utilizando minigenes y secuenciación genómica, hemos podido descartar razonablemente la contribución de sustituciones de nucleótido en la secuencia genómica de BRAF como responsables de la generación de estas isoformas. Un screening masivo de knockout génico mediante CRISPR-Cas9 nos ha permitido identificar vulnerabilidades génicas en células de melanoma relacionadas con splicing y dinámica de cromatina, pero no factores de splicing implicados específicamente en la generación de BRAF3-9. De especial relevancia, hemos identificado deleciones intragénicas de gran tamaño como el mecanismo responsable de la producción de las isoformas BRAF3-9 y BRAF1-9, lo que sugiere que éste puede ser un mecanismo general para la producción de isoformas de mRNA asociadas con la adquisición de resistencia en melanoma.