Identification of Novel Immunomodulatory Strategies to Tackle HIV-1 Persistence

Abstract

La teràpia antiretroviral (TAR) ha millorat dràsticament l'esperança de vida de les persones amb VIH (PLWH), però no és curativa i s'ha de prendre tota la vida. La persistència del VIH en reservoris latents transcripcionalment silenciosos però competents per a la replicació és una barrera important per a la cura del VIH. Per tant, cal el desenvolupament de noves estratègies dirigides a eliminar el reservori viral latent per avançar cap a la cura del VIH. Entre elles cal destacar l'estratègia coneguda com a "shock and kill" que utilitza agents reversors de latència (LRA) per induir la transcripció viral, exposant les cèl·lules latentment infectades a l'eliminació per part del sistema immune o l'estratègia coneguda com a "block and lock ", la qual persegueix el silenciament permanent de la transcripció viral utilitzant agents promotors de latència (LPA). Tenint en compte l'heterogeneïtat del reservori latent que comprèn cèl·lules de diferents llinatges, hem desenvolupat models cel·lulars de latència del VIH-1 no clonals utilitzant línies cel·lulars d'origen limfoide o mieloide, amb l'objectiu d'identificar nous LRA. Hem realitzat un cribratge d'alt rendiment (HTS) d'una biblioteca de compostos utilitzant aquests models de latència del VIH-1, identificant una sèrie d'agents amb activitat com a LRA en múltiples tipus cel·lulars. Hem identificat dues classes d'agents immunomoduladors com a nous LRA en aquests models: els inhibidors de IκB/IKK (IKKis) i els inhibidors de JAK (JAKi). Com es va descriure anteriorment per a l'acitretina i els agonistes de TLR, la modulació de l'estimulació immunitària innata podria afectar la latència viral i contribuir a eliminar el reservori del VIH. En el primer capítol de la tesi, hem avaluat la la capacitat com a LRA dels IKKis en ambdós models cel·lulars de latència del VIH. Els nostres resultats demostren el potencial LRA dels IKKis, tant en cèl·lules d'origen limfoide com mieloide. En particular, els inhibidors selectius dirigits a TBK1 i IKKε van ser capaços de reactivar la latència viral a través d'un mecanisme dirigit a la inducció de la transcripció del VIH mitjançada per NF-κB, tant in vitro com ex vivo. Atès que l'activació immunitària associada amb el VIH i les respostes hiperinflamatòries persisteixen a les PLWH, també hem avaluat l'efecte dels IKKis en la funció de les cèl·lules immunitàries, observant que l'activitat com a LRA dels IKKi no va alterar l'estat d'activació a les cèl·lules T CD4+, alhora que presentava una disminució significativa de les respostes proinflamatòries. En el segon capítol de la tesi, s'ha avaluat la la capacitat LRA dels JAKi, com una potencial estratègia terapèutica per a la cura del VIH-1. Contràriament al paper inhibidor de la reactivació viral descrit anteriorment per a determinats JAKi, hem identificat una subclasse d'inhibidors selectius de JAK2 (JAK2i) que van revertir significativament la latència del VIH. En particular, l'inhibidor de JAK2i fedratinib, va revertir la latència del VIH-1 in vitro en els models limfoides i mieloides no clonals així com també ex vivo en cèl·lules T CD4+ de PLWH, independentment de l'expressió de JAK2. Per descriure el mecanisme d'acció subjacent a la reversió de la latència induïda per JAK2i, hem avaluat l'expressió gènica global, identificant una regulació positiva significativa de l'expressió d'IRF7 malgrat el bloqueig de la via JAK-STAT i la regulació negativa de citocines i quimiocines proinflamatòries. A més, els nivells d'expressió de IRF7 es van correlacionar positivament amb la capacitat de reversió de la latència del VIH dels inhibidors de JAK2 i d'altres LRA. En conjunt, aquests resultats demostren el potencial de la modulació immunitària innata per reduir el reservori viral mitjançant una via depenent de IRF7.

La terapia antirretroviral (TAR) ha mejorado drásticamente la esperanza de vida de las personas con VIH (PLWH), pero no es curativa y debe tomarse de por vida. La persistencia del VIH en reservorios latentes transcripcionalmente silenciosos pero competentes para la replicación es una barrera importante para la cura del VIH. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de nuevas estrategias dirigidas a eliminar el reservorio de VIH latente para avanzar hacia la cura del VIH. Entre ellas cabe destacar la estrategia conocida como "shock and kill" que utiliza agentes reversores de latencia (LRA) para inducir la transcripción viral, exponiendo las células latentemente infectadas a la eliminación por parte del sistema inmune o la estrategia conocida como "block and lock", la cuál persigue el silenciamiento permanente de la transcripción viral utilizando agentes promotores de latencia (LPA). Teniendo en cuenta la heterogeneidad del reservorio latente que comprende células de distintos linajes, hemos desarrollado modelos celulares de latencia del VIH-1 no clonales utilizando líneas celulares de origen linfoide o mieloide, con el objetivo de identificar nuevos LRA. Realizamos un cribado de alto rendimiento (HTS) de una biblioteca de compuestos utilizando estos modelos de latencia del VIH-1, lo que permitió la identificación de LRA con actividad en múltiples tipos celulares. Identificamos dos clases de agentes inmunomoduladores como nuevos LRA en estos modelos: inhibidores de IκB/IKK (IKKis) e inhibidores de JAK (JAKi). Como se ha descrito anteriormente para acitretina y los agonistas de TLR, la modulación de la inmunidad innata podría afectar la latencia viral y contribuir a la eliminación del reservorio de VIH. En el primer capítulo de la tesis, nos centramos en validar la capacidad como LRA de los IKKis en ambos modelos celulares de latencia del VIH. Nuestros resultados demuestran el potencial LRA de los IKKis, tanto en células de origen linfoide como mieloide. En particular, los inhibidores selectivos de TBK1 e IKKε fueron capaces de revertir la latencia viral a través de un mecanismo dirigido a la inducción de la transcripción del VIH mediada por NF-κB, tanto in vitro como ex vivo. Dado que la activación inmunitaria asociada con el VIH y las respuestas hiperinflamatorias persisten en las PLWH, también evaluamos el efecto de IKKis en la función de las células inmunitarias y observamos que la actividad LRA de IKKi no alteró el estado de activación en las células T CD4+, a la vez que presentaba una disminución significativa de las respuestas proinflamatorias. En el segundo capítulo de la tesis, evaluamos la capacidad LRA de los JAKi como una potencial estrategia terapéutica novedosa para la cura del VIH-1. Contrariamente al papel inhibidor de la reactivación viral descrito anteriormente para determinados JAKi, identificamos una subclase de inhibidores selectivos de JAK2 (JAK2i) capaces de revertir significativamente la latencia del VIH. En particular, el JAK2i fedratinib, revirtió la latencia del VIH-1 in vitro en los modelos linfoides y mieloides no clonales y también ex vivo en células T CD4+ de PLWH, independientemente de la expresión de JAK2. Para delinear el mecanismo de acción subyacente a la actividad LRA inducida por los JAK2i, realizamos un análisis transcriptómico completo, identificando una regulación positiva significativa de la expresión de IRF7 a pesar del bloqueo de la vía JAK-STAT y la regulación negativa de citocinas y quimiocinas proinflamatorias. Además, los niveles de expresión de IRF7 se correlacionaron positivamente con la capacidad de reversión de la latencia del VIH de los JAK2i y otros LRA. En conjunto, estos resultados demuestran el potencial de la modulación inmunitaria innata para reducir el reservorio viral a través de la vía mediada por IRF7.

Antiretroviral therapy (ART) has dramatically improved the life expectancy for people with HIV (PLWH), but it is not curative and must be taken for life. The persistence of HIV in transcriptionally silent but replication-competent latent reservoirs is a major barrier to HIV cure. Thus, strategies targeting the latent HIV reservoir are crucial in achieving HIV cure, as the "shock and kill" strategy using latency reversing agents (LRAs) to induce virus transcription, exposing latent HIV to immune clearance, or the permanent silencing of viral transcription using latency promoting agents (LPAs) in the "block and lock" strategy. Considering the heterogeneity of the latent reservoir comprising cells from distinct lineages, we developed non-clonal cellular models of HIV-1 latency using cell lines from lymphoid or myeloid lineage for identifying new LRAs. We performed a high-throughput screening (HTS) of an anticancer compound library using these models of HIV-1 latency, allowing the identification of LRAs with potent activity across multiple cell lineages. Interestingly, we identified two classes of innate immunomodulating agents as novel LRAs in these models: IκB/IKK inhibitors (IKKis) and JAK inhibitors (JAKi). As previously described for acitretin and TLR agonists, modulation of innate immune stimulation could impact viral latency and contribute to the clearance of the HIV reservoir. In the first chapter of the thesis, we focused on validating the LRA capacity of IKKis in both models of HIV latency. Our results show the latency-reversing activity of IKKis in HIV-1 latently infected lymphoid and myeloid compartments. In particular, selective inhibitors targeting TBK1 and IKKε showed relevant HIV reactivation capacities through a mechanism of NF-κB-induced HIV transcription in vitro and ex vivo. Since HIV-associated immune activation and hyperinflammatory responses persist in PLWH, we also evaluated the IKKis effect on immune cell function, observing that the LRA activity of IKKi did not alter the activation status in CD4+T cells, concomitant with significantly decreased proinflammatory responses. Next, in the second chapter of the thesis, we characterized the latency reactivation capacity of JAKi as a potential novel therapeutic strategy for HIV-1 cure. We observed that contrary to the previously described role of JAKi as potent inhibitors of latency reactivation, a subclass of selective JAK2 inhibitors (JAK2i) showed a significant capacity for reversing HIV latency. Notably, the JAK2i fedratinib reversed HIV-1 latency in non-clonal lymphoid and myeloid in vitro models of HIV-1 latency and ex vivo in CD4+ T cells from ART+ PLWH, albeit its function was not dependent on JAK2 expression. To delineate the mechanism of action for JAK2i-induced latency reactivation, we performed whole transcriptomic analysis, identifying a significant upregulation of IRF7 expression despite the blockade of the JAK-STAT pathway and downregulation of proinflammatory cytokines and chemokines. Moreover, IRF7 expression levels positively correlated with HIV latency reactivation capacity of JAK2 inhibitors and other common LRAs. Furthermore, we characterized the latency promoting capacity of the JAK2i pacritinib, demonstrating its potency in blocking LRA-induced reactivation in vitro and in ex vivo-treated primary cells from PLWH. These results were consistent with the relevance of JAK-STAT signalling blockade as a strategy to prevent HIV-1 latency reversal. Collectively, these results represent a promising step towards HIV eradication by demonstrating the potential of innate immune modulation for reducing the viral reservoir through a novel pathway driven by IRF7. Overall, our studies highlight the diverse outcomes of modulating immune responses to target HIV persistence in latent reservoirs, either reactivating HIV-1 latency as the TBKi/IKKi and the selective JAK2i fedratinib or epigenetic silencing of the provirus as the JAK2i pacritinib, here described. In addition, the capacity for counteracting chronic immune activation and dysregulated inflammatory responses make immune-modulating agents interesting candidates for combination therapy with ART.