Immune response to vaccination with CAF®01 or CDA adjuvanted conserved antigens from porcine viral and bacterial pathogens

Abstract

El porc és susceptible a una gran varietat de patògens en edats primerenques com per exemple el virus d'influença (VI) o els bacteris Glaesserella parasuis i Streptococcus suis. Avui dia els efectes d'aquests patògens poden evitar-se amb una bona gestió sanitària dels ramats o amb tractament antibiòtic, i en menor mesura, a través de vacunació. No obstant, tant l'emergència de noves variants víriques així com també de noves soques bacterianes amb resistències antimicrobianes fa necessari buscar alternatives efectives per combatre les infeccions i així millorin la salut dels animals. En aquest sentit, la vacunació representa una excel·lent estratègia per prevenir les malalties infeccioses. Tanmateix, les vacunes disponibles contra aquestes malalties no ofereixen una resposta immune prolongada o protectora contra diferents soques del mateix patogen. Per això, l'ús d'antígens relativament conservats pot esdevenir una estratègia per aconseguir vacunes immunogèniques, efectives i segures. En aquesta Tesi doctoral es proposa identificar una combinació efectiva d'antigen/adjuvant capaç de reforçar la resposta immunitària innata i adaptativa i així conferir protecció contra un determinat patogen. Per a això s'han avaluat en tres estudis la immunogenicitat i eficàcia d' antígens conservats en combinació amb l' adjuvant liposòmic CAF®01 o el dinucleòtid cíclic CDA. El primer estudi (capítol III), avalua l'eficàcia i immunogenicitat del pèptid de l'hemaglutinina NG34 adjuvantat amb CAF®01 o amb la combinació de CDA/αGCM. Garrins joves es van vacunar dos cops en un interval de 21 dies i infectar experimentalment amb una soca de VI pandèmica pdmH1N1 per vies intranasal i endotraqueal. La vacunació amb NG34+CAF®01 va produir mes anticossos específics i cèl·lules secretores d'IFN-γ, que a més es va correlacionar amb una menor patologia en pulmó així com també menor carrega vírica. En canvi, la formulació NG34+CDA/αGCM va generar una resposta immune dèbil sense reducció de càrrega vírica i amb una variable patologia compatible amb Influença. En el segon estudi (capítols IV i V) s'analitza la vacunació neonatal amb el fragment proteic F4, una seqüència conservada en les soques virulentes de G. parasuis. L'estudi es divideix en dues parts: en la primera part es descriu la resposta immune després de la vacunació de amb la proteïna F4 adjuvantada amb CAF®01 o amb CDA mentre que en la segona part es detalla el procés d'infecció dels animals després d'inocular el serotip 5 de G. parasuis per via intraperitoneal. A l'inici de l'estudi es va detectar una colonització nasal natural per part d'una soca heteròloga de G. parasuis. Els animals vacunats amb la combinació d' F4+CAF®01 van ser capaços de reduir la càrrega d'aquesta soca a dia 38 post-vacunació en absència d'anticossos. També es va observar que la combinació d'F4+CDA va generar una resposta humoral específica amb IgGs anti-F4 encara que variable dins del grup. Així mateix es van valorar la resposta immune cel·lular mitjançant citometria de flux, on es va veure que la colonització amb G. parasuis va afectar els paràmetres analitzats. En la segona part de l'estudi, es descriuen els efectes de la inoculació intraperitoneal en els animals vacunats, on es va poder copsar l'afectació generalitzada en tots els grups sense diferències, dificultant la correcta avaluació dels candidats vacunals. Finalment, en el tercer estudi (capítol VI) s'examina la immunogenicitat i eficàcia de dues proteïnes de la paret cel·lular d'S. suis: els antígens MRP2 i C05. Garrins nounats es van vacunar en dues tandes amb ambdós antígens adjuvantats amb CAF®01 o bé amb CDA i infectats experimentalment intranasalment amb una soca de serotip 2 d'S. suis. Ambdues combinacions van produir una immunogenicitat dèbil, tant humoral com cel·lular, incapaç de protegir els animals front a la infecció a diferencia dels animals immunitzats amb autovacuna.

El cerdo es una especie susceptible a una gran variedad de patógenos que afectan a su salud especialmente en edades tempranas como por ejemplo el virus de influenza (VI), o las bacterias Glaesserella parasuis y Streptococcus suis. Actualmente la infección por dichos patógenos puede evitarse gracias a una buena gestión sanitaria de los rebaños o con tratamiento antibiótico y, en menor medida, a través de vacunación. Sin embargo, la emergencia de nuevas variantes víricas o cepas bacterianas con resistencias antimicrobianas obliga a buscar alternativas efectivas para combatir las infecciones y así mejorar la salud de los animales. En este sentido, la vacunación representa una excelente herramienta para prevenir las enfermedades infecciosas. Sin embargo, las vacunas disponibles frente a las enfermedades mencionadas no ofrecen una respuesta inmune prolongada o protectora contra diferentes cepas del mismo patógeno. Por esta razón, el uso de antígenos relativamente conservados puede convertirse en una estrategia para obtener vacunas inmunogénicas, efectivas y seguras. En la presente Tesis Doctoral se propone identificar una combinación efectiva de antígeno/adyuvante capaz de reforzar la respuesta inmunitaria innata y adaptativa para así conferir protección contra un determinado patógeno. Para ello se han evaluado la inmunogenicidad y eficacia de antígenos conservados en combinación con el adyuvante liposómico CAF®01 o el dinucleótido cíclico CDA. El primer estudio (capítulo III) evalúa la eficacia e inmunogenicidad del péptido NG34 de la hemaglutinina del virus de Influenza en combinación con los adyuvantes CAF®01 o CDA/αGCM. Cerdos jóvenes fueron doblemente inmunizados y posteriormente infectados con una cepa de VI pandémica pdmH1N1 por vías intranasal y endotraqueal. La vacunación con NG34+CAF®01 produjo una mayor cantidad anticuerpos específicos y células secretoras de IFN-γ, que además se correlacionó con una menor patología en pulmón, así como menor carga vírica. Por el contrario, la formulación NG34+CDA/αGCM generó una respuesta inmune débil sin reducción de carga vírica y con una patología compatible con Influenza variable. En el segundo estudio (capítulos IV y V), se analiza la vacunación neonatal con el fragmento proteico F4, una secuencia conservada en las cepas virulentas de G. parasuis. El estudio se divide en dos partes: en la primera parte se describe la respuesta inmune tras la vacunación con la proteína F4 en combinación con los adyuvantes CAF®01 o CDA, mientras que en la segunda parte se detalla el proceso de infección de los animales después de la inoculación intraperitoneal del serotipo 5 de G. parasuis. Al inicio del estudio se detectó una colonización nasal natural por parte de una cepa heteróloga de G. parasuis. Los animales vacunados con la combinación de F4+CAF®01 fueron capaces de reducir la carga de esta cepa a día 38 en ausencia de anticuerpos. También se observó que la combinación de F4+CDA generó una respuesta humoral específica, aunque variable dentro del mismo grupo. Asimismo, se valoró la respuesta inmune celular mediante citometría de flujo, donde la colonización con la cepa oportunista afectó a los parámetros analizados. En la segunda parte del estudio, se pudo apreciar que la infección intraperitoneal afectó a todos los grupos de forma generalizada sin diferencias, dificultando la correcta evaluación de los candidatos vacunales. Por último, el tercer estudio (capítulo VI) examina la inmunogenicidad y eficacia de dos proteínas de la pared celular de S. suis: los antígenos MRP2 y C05. Lechones neonatos fueron doblemente vacunados con ambos antígenos en combinación con los adyuvantes CAF®01 o CDA e infectados por vía intranasal con una cepa de serotipo 2 de S. suis. Ambas combinaciones produjeron una inmunogenicidad débil, tanto humoral como celular, incapaz de proteger a los animales frente a la infección en comparación con los animales inmunizados con autovacuna.

Swine is especially susceptible to a wide variety of pathogens at younger ages as for instance viruses like influenza virus (IV), or bacteria such as Glaesserella parasuis, and Streptococcus suis. Disease caused by these pathogens can be prevented by good husbandry practices with the herds or by antimicrobial treatment, and to a lesser extent, vaccination. However, due to the risk of new emerging strains and antimicrobial resistances compels to look for effective alternatives to control infections and improve the animal health. In this respect, vaccination is probably the best tool for infectious diseases prevention. Nonetheless, current vaccines do not confer long lasting or protective immune responses against heterologous strains of these pathogens. For this reason, the use of relatively well-conserved antigens may become an approach to obtain immunogenic, effective, and safe vaccines. In this PhD dissertation, we aimed to identify effective antigen/adjuvant combinations capable of strengthening the innate and adaptive immune responses and confer protection against a given pathogen. Hence, the immunogenicity and efficacy of conserved antigens were assessed in combination with the liposome-based adjuvant CAF®01 or the cyclic dinucleotide CDA. The first study of this work (chapter III) assessed the immunogenicity and efficacy of IV hemagglutinin peptide NG34 adjuvanted with CAF®01 or CDA/αGCM. Young pigs were twice immunized in an interval of 21 days and challenged afterwards with pdmH1N1 strain by the intranasal and endotracheal routes. In this experiment, NG34+CAF®01 immunized animals elicited a stronger specific humoral and cell mediated immune response with high amounts of specific IgGs and IFN-γ secreting cells that correlated with less pathology and viral load in lung. On the contrary, NG34+CDA/αGCM formulation showed a weak immune response correlated with variable IV compatible lesions and no reduction of viral load. In the second study (chapters IV and V), the vaccination with the F4 protein (conserved protein fragment of virulent strains of G. parasuis) was evaluated in neonate piglets. The study is divided in two parts: in the first part, the immune responses to neonate vaccination with CAF®01 or CDA adjuvanted F4 protein was assessed; in the second part, results of the intraperitoneal challenge with serovar 5 of G. parasuis are presented. Soon after the beginning of the study a natural nasal colonization by a heterologous strain of G. parasuis was detected in the animals. Piglets vaccinated with F4+CAF®01 were capable of reducing the bacterial colonization in their nasal cavities on day 38 in the absence of specific antibodies. It was also observed an enhanced, albeit variable specific humoral response in animals immunized with F4+CDA. Similarly, cell-mediated immune responses were evaluated by flow-cytometry where it was noted that nasal colonization by the heterologous strain of G. parasuis affected the immune parameters far beyond than expected. In the second part of the study (chapter V), the intraperitoneal inoculation with serovar 5 of G. parasuis is described. Challenge affected severely all the groups without differences, hampering the correct evaluation of the vaccine candidate's efficacy. Finally, the third study (chapter VI) evaluated the immunogenicity and efficacy of two cell-wall proteins of Streptococcus suis (MRP2 and C05 antigens). New-born piglets were twice vaccinated with both antigens adjuvanted with either CAF®01 or CDA and finally challenged by intranasal inoculation with serovar 2 of S. suis. In this experiment both combinations elicited weak immune responses, unable to protect the animals against the infection unlike piglets immunized with autogenous vaccine.