Genetic and molecular study of Brassinosteroid receptors in Sorghum bicolor

Abstract

La importància dels brasinosteroides per al desenvolupament de les plantes i la seva adaptació a diferents tipus d’estrès, biòtic i abiòtic, ha estat demostrada. El nostre treball previ amb Arabidopsis va demostrar que BRL3, un dels receptors de brasinosteroides discretament expressat, intervé en la resposta adaptativa d’aquestes plantes a sequera, i plantes sobreexpressores de BRL3 toleren millor la sequera. Per tant, volíem comprovar si aquest mecanisme d’adaptació està conservat en un dels cultius més importants a les zones àrides i semiàrides del planeta, Sorghum bicolor. Al primer capítol, identifiquem els dos gens receptors de brasinosteroides a Sorghum bicolor. La seqüència genètica i l’estructura proteica 3D de BRI1 va ser analitzada mostrant un alt grau de conservació. A més, vam comprobar que són funcionals mitjançant complementació heteròloga a Arabidopsis. Al segon capítol, una col·lecció mutagenitzada va ser cribada amb l’objectiu d’aïllar sis mutants de receptors de brasinosteroides. Les plantes van ser retrocreuades per eliminar mutacions en el fons genètic i així obtenir poblacions segregants per al fenotipat de les plantes. Així mateix, diferents d’aquestes línies van ser sotmeses a estrès per sequera ia temperatures elevades. El tercer capítol es reporten els esforços per establir el protocol de transformació de sorgo al nostre laboratori. El sorgo és conegut com una espècie recalcitrant a transformació. Així doncs, vam establir una col·laboració amb el laboratori del Prof. Ian Godwin, a Austràlia. Els resultats obtinguts al CRAG durant dos anys diferents van ser comparats amb els resultats obtinguts durant una estada internacional a QAAFI (Austràlia). Vam obtenir plantes transgèniques de sorgo que seran útils per a altres investigacions. En general, l’objectiu d’aquesta tesi doctoral és contribuir a la recerca translativa de biologia molecular cap a l’agricultura. En aquesta direcció, aconseguim establir la investigació sobre sorgo al CRAG, adaptar protocols d’Arabidopsis a sorgo i establir condicions per al fenotipat en condicions de sequera i elevades temperatures per a aquesta planta tan resilient. A més, l’escàs material genètic per a la investigació de brasinosteroides en sorgo ha estat ampliat, proveint valuoses eines per a futures investigacions en aquesta planta ben adaptada a les condicions ambientals extremes.

Los brasinosteroides son fitothormonas esenciales para el desarrollo de las plantas y su adaptación a diferentes tipos de estrés ambiental. Nuestro trabajo previo en Arabidopsis demostró que BRL3, uno de los receptores de brasinosteroides, interviene en la respuesta adaptativa de estas plantas a la sequía. Las plantas sobreexpresoras de BRL3 toleran mejor la sequía sin penalizar el rendimiento. Por lo tanto, queríamos comprobar si este mecanismo de adaptación está conservado en uno de los cultivos más importantes en las zonas áridas y semiáridas del planeta, el Sorghum bicolor. En el primer capítulo, identificamos los dos genes receptores de brasinosteroides en el genoma de Sorghum bicolor. Su secuencia genética y la estructura proteica 3D de BRI1 fue analizada mostrando un alto grado de conservación. Además, comprobamos que son funcionales mediante complementación heteróloga en Arabidopsis. En el segundo capítulo, se identificaron varios alelos mutantes en los receptores de brasinosteroides a partir de una colección existente de mutantes. Las plantas fueron retrocruzadas dos veces, para eliminar mutaciones en el fondo genético y así obtener poblaciones segregantes para el fenotipado de las plantas. Asimismo, diferentes de estas líneas fueron sometidas a caracterización fisiológica, en ensayos de estrés por sequía y a temperaturas elevadas. En el tercer capítulo se reportan los avances hacia el establecimiento de un protocolo de transformación de sorgo en nuestro laboratorio. El sorgo es conocido como una especie recalcitrante a transformación. Así pues, establecimos una colaboración con el laboratorio del Prof. Ian Godwin, en Australia. Los resultados obtenidos en el CRAG durante dos años diferentes fueron comparados con los resultados obtenidos durante mi estancia internacional en QAAFI (Australia). Obtuvimos plantas transgénicas de sorgo que serán útiles para investigaciones futuras. En general, el objetivo de esta tesis doctoral es contribuir a la biología traslacional y aportar valor en la agricultura frente a los retos del cambio climático. En esa dirección, logramos establecer de manera pionera una línea de investigación en sorgo en el CRAG, adaptar y desarrollar nuevos protocolos de Arabidopsis a sorgo, y establecer condiciones para el fenotipado en condiciones de sequía y elevadas temperaturas. Además, el escaso material genético para la investigación de brasinosteroides en sorgo ha sido ampliado, proveyendo valiosas herramientas para futuras investigaciones en este cultivo tan resiliente a condiciones ambientales extremas.

Brassinosteroids have been proven to be of great importance for the development of plants but also in the adaptation of plants to different biotic and abiotic stresses. Our previous work in Arabidopsis showed that BRL3, a discretely expressed Brassinosteroid receptor, intervenes in the adaptative response of plants to drought, and BRL3 overexpressing plants were tolerant to drought. Therefore, we wanted to test whether this adaptative mechanism is conserved in one of the most important crops in arid and semiarid zones of the planet, Sorghum bicolor. In the first chapter, we identified the two Brassinosteroid receptor genes of Sorghum bicolor. Their genetic sequence and the protein 3D structure of BRI1 was analysed showing a high degree of conservation. Furthermore, we tested their functionality through heterologous complementation in Arabidopsis. In the second chapter, a mutagenized collection was screened in an effort to isolate six sorghum brassinosteroid receptor mutants. The plants were backcrossed to eliminate background mutations and to obtain segregant populations for plant phenotyping. Furthermore, different lines were subjected to drought and elevated temperature stresses, showing that both receptors control abiotic stress responses. The third chapter constitutes an effort to establish sorghum transformation protocol in our laboratory. Sorghum is known to be a recalcitrant specie for transformation. Thus, we established a collaboration with the laboratory of Prof. Ian Godwin, in Australia. The results obtained at CRAG during two years were compared with the results obtained during an international stay in QAAFI (Australia). We obtained transgenic sorghum plants, which will be a useful tool for further research. Overall, the aim of the present PhD thesis is to contribute to the translational research from molecular biology to agriculture. Towards this direction, we managed to set Sorghum research at CRAG, adapt protocols from Arabidopsis to Sorghum, and set conditions for drought and elevated temperature experiments with this resilient crop. Furthermore, the scarce genetic materials for brassinosteroid research in Sorghum has been extended, providing valuable tools for future research in this well-adapted plant to the upcoming environmental conditions.