Efecto de FTY720/Fingolimod sobre el desarrollo de cardiomiopatía diabética e identificación de nuevos candidatos a biomarcadores derivados del metabolismo de esfingolípidos en un modelo experimental (ratones db/db)

Abstract

La cardiomiopatia diabètica (CMD) és una de las principals complicacions de la diabetis. Actualment no es disposen ni de biomarcadors específics per al seu diagnòstic/pronòstic, ni d’un tractament dirigit. Objetius: En aquest treball es va analitzar la relació entre el perfil de ceramides circulants i les alteracions metabòliques i cardíaques relacionades amb la CMD en models experimentals d’obesitat i insulinoresistència (ratolins db/+ alimentats amb una dieta rica en greixos) i de DM2 (ratolins db/db). També es va estudiar el metabolisme d’LDLox en ratolins db/db i la seva contribució en l’acumulació de lípids i l’apoptosi en cardiomiòcits humans (AC16) en condicions de DM2. D’altra banda, es va avaluar l’efecte del tractament amb FTY720/Fingolimod sobre signes de CMD en ratolins db/db. Resultats: Contribució del metabolisme d’esfingolípids a la CMD. Els ratolins obesos no van presentar signes de CMD després de 5 mesos en una dieta rica en greixos. En aquests ratolins els nivells plasmàtics de Cer 18:0 es van correlacionar directament amb els determinats a miocardi. D’altra banda, durant el seguiment dels ratolins db/db (4 mesos) un subgrup va desenvolupar un fenotip de DM2 més avançada (ratolins db/dbcat). Tant en ratolins db/db com db/dbcat, es van detectar signes de disfunció diastòlica acompanyada de les fraccions d’ejecció/escurçament preservadas. El contingut de ceramides miocàrdiques en ratolins db/db no va diferir del dels no diabètics, mentre que es van trobar disminuïdes en miocardi de ratolins db/dbcat. Ambdós models animals van mostrar nivells plasmàtics de Cer 18:0 augmentats i directament relacionats amb els seus nivells hepàtics. Quant a les LDLox, la seva captació augmentada en miocardis de ratolins db/db; possiblement a través de receptors CD36 i LDLR/LRP1 tal i com es va observar en cultius de cardiomiòcits AC16. La presència d’LDLox va induir apoptosi tardana i mort cel·lular in vitro. Efecte de FTY720/Fingolimod sobre la CMD. L’administració oral d’FTY720/Fingolimod va prevenir el desenvolupament de CMD en ambdós grups de ratolins db/db. Això es va acompanyar d’una millora en la inflamació sistèmica. Amb tot, i a diferència dels ratolins db/dbcat, la disfunció cardíaca en ratolins db/db es va acompanyar de canvis en l’expressió gènica de marcadors involucrats en la dinàmica mitocondrial miocárdica, mentre que els miocardis de ratolins db/dbcat van mostrar uns nivells d’inflamació, estrès de reticle endoplasmàtic (RE) i apoptosi augmentats. FTY720/Fingolimod va prevenir del desenvolupament de la CMD in vivo després de 3 mesos de tractament en ambdós grups de ratolins db/db. En ratolins db/db aquesta millora es va relacionar amb una disminució de l’expressió gènica de marcadors involucrats en la dinàmica mitocondrial, mentre que en ratolins db/dbcat es va relacionar amb una disminució en la abundància relativa de TNFα en miocardi i d’Nf-kB p65 en nuclis celul·lars. i també de la forma activa de la caspasa 3. A més a més, es va observar una reducció significativa en l’expressió gènica de marcadors d’estrès de RE en miocardis de ratolins tractats. Els efectes anti-inflamatori i anti-apoptòtic descrits in vivo es van confirmar en cardiomiòcits humans AC16 incubats amb FTY720/Fingolimod. Conclusions: Els ratolins db/db i db/dbcat van presentar signes de CMD. Els nivells de Cer 18:0 circulants es van trobar augmentats en ambdós models. A diferència dels ratolins db/dbcat, la disfunció miocàrdica en el model db/db no es va acompanyar de canvis en la inflamación, estrès de RE i apoptosi, sino amb signes d’una dinàmica mitocondrial alterada. L’administració d’FTY720/Fingolimod va protegir contra el desenvolupament de CMD. En ambdós grups de ratolins db/db el tractament va mostrar un efecte anti-inflamatori sistèmic, però només en ratolins db/dbcat, aquesta millora cardiaca es va trobar associada a un efecte anti-inflamatori i anti-apoptòtic en miocardis de ratolins tractats.

La cardiomiopatía diabética (CMD) es una de las principales complicaciones de la diabetes. Actualmente no se disponen de biomarcadores específicos para su diagnóstico/pronóstico ni de un tratamiento dirigido. Objetivos: En este trabajo se analizó la relación entre el perfil circulante de ceramidas y las alteraciones metabólicas y cardiacas de la CMD en modelos experimentales de obesidad e insulinoresistencia (ratones db/+ alimentados con una dieta rica en grasas) y de DM2 (ratones db/db). También se estudió el metabolismo de LDLox en ratones db/db y su contribución en la acumulación de lípidos y la apoptosis en cardiomiocitos humanos (AC16) en condiciones de DM2. Por otro lado, se evaluó el efecto del tratamiento con FTY720/Fingolimod sobre signos de CMD en ratones db/db. Resultados: Contribución del metabolismo de esfingolípidos a la CMD. Los ratones obesos no presentaron signos de CMD tras 5 meses en una dieta rica en grasas. En estos ratones los niveles plasmáticos de Cer 18:0 se encontraron aumentados y directamente correlacionaron con los medidos en miocardio. Por otro lado, durante el seguimiento de ratones db/db (4 meses) un subgrupo desarrolló un fenotipo de DM2 más avanzado (ratones db/dbcat). Tanto en ratones db/db y db/dbcat, se detectaron signos de disfunción diastólica acompañada de las fracciones de eyección/acortamiento preservadas. El contenido de ceramidas miocárdicas en ratones db/db no difirió del de los no diabéticos, mientras que se encontraron disminuidas en miocardio de ratones db/dbcat. Ambos modelos animales exhibieron niveles plasmáticos de Cer 18:0 incrementados y directamente relacionados con sus niveles hepáticos. En cuanto a las LDLox, su captación se vio aumentada en miocardios de ratones db/db; posiblemente mediada a través de receptores CD36 y LDLR/LRP1 tal y como se observó en cultivos de cardiomiocitos AC16. La presencia de estas LDLox indujo apoptosis tardía y muerte celular in vitro. Efecto de FTY720/Fingolimod sobre la CMD. La administración oral de FTY720/Fingolimod protegió contra el desarrollo de CMD en ambos grupos de ratones db/db. Esto se acompañó de una mejora en la inflamación sistémica. Sin embargo, y a diferencia de los ratones db/dbcat, la disfunción cardíaca en ratones db/db se acompañó de cambios en la expresión génica de marcadores involucrados en la dinámica mitocondrial miocárdica, mientras que los miocardios de ratones db/dbcat exhibieron unos niveles de inflamación, estrés de retículo endoplasmático (RE) y apoptosis aumentados. FTY720/Fingolimod previno del desarrollo de la CMD in vivo tras 3 meses de tratamiento en ambos grupos de ratones db/db. En ratones db/db esta mejora se relacionó con una disminución de la expresión génica de marcadores involucrados en la dinámica mitocondrial, mientras que en ratones db/dbcat se relacionó con una disminución en la abundancia relativa de TNFα en miocardio y de Nf-kB p65 en núcleos celulares, así como de la forma activa de la caspasa 3. Además se observó una reducción significativa en la expresión génica de marcadores de estrés de RE en miocardios de ratones tratados. Los efectos antiinflamatorio y anti-apoptótico de FTY720/Fingolimod se confirmaron en cardiomiocitos humanos AC16. Conclusiones: Los ratones db/db y db/dbcat, presentaron signos de CMD. Este fenotipo se acompañó de unos niveles aumentados de Cer 18:0 circulantes. A diferencia de los ratones db/dbcat, la disfunción miocárdica en el modelo db/db no se acompañó de cambios en inflamación, estrés de RE y apoptosis, sino con signos de una dinámica mitocondrial alterada. La administración de FTY720/Fingolimod protegió contra el desarrollo de CMD. En ambos grupos de ratones db/db el tratamiento mostró un efecto antiinflamatorio sistémico, pero solo en ratones db/dbcat, esta mejora cardiaca se relacionó con un efecto antiinflamatorio y anti-apoptótico en miocardios de ratones tratados.

Diabetic cardiomiopathy (DCM) represents one of the main hidden complications of diabetes. Currently there are not specific biomarkers for its diagnosis/prognosis nor a specific therapy. Goals: In this work the relationship between the circulating ceramide profile and metabolic and cardiac alterations related to DCM was analyzed using experimental models of obesity and insulin resistance (db/+ mice made obese with a high-fat diet) and type 2 diabetes (T2D) (db/db mice). The metabolism of oxLDL in db/db mice and their contribution to lipid accumulation and apoptosis was studied in human cardiomyocytes (AC16) in conditions mimicking T2D; as it was the role of lipoprotein receptors involved in their uptake. On the other hand, the effect of FTY720/Fingolimod on the cardiac structure and function in db/db mice was also studied. Results: Contribution of sphingolipid metabolism to DCM. The obese mice did not develop signs of DCM after 5 months of follow-up on a high-fat diet. In these mice the plasma levels of Cer 18:0 were increased and directly related to those determined in myocardium. On the other hand, during the follow-up of db/db mice (4 months) the diabetic phenotype of a group of them was exacerbated, showing decreased circulating concentrations of insulin and adiponectin (db/dbcat). Both db/db y db/dbcat mice showed signs of diastolic disfunction with preserved ejection/shortening fractions. The myocardial ceramide content in db/db mice did not differ from that of non-diabetic mice. Conversely, the myocardial content of ceramides was decreased in db/dbcat mice. Interestingly, both db/db mice groups exhibited increased plasma levels of Cer 18:0 that were directly to their hepatic levels. Regarding the oxLDL, our data revealed an increased myocardial oxLDL uptake in db/db mice; being this at least partially explained by possibly via lipoprotein receptors CD36 y LDLR/LRP1 as shown in in vitro analysis with AC16 cardiomyocytes. The addition of oxLDL enhanced late apoptosis and death in cultured cardiomyocytes. Effect of FTY720/Fingolimod on DCM. FTY720/Fingolimod prevented the development of DCM in both db/db mice groups. This was accompanied with an improved systemic inflammation in treated db/db mice. However, in contrast with db/dbcat mice, cardiac dysfunction in db/db mice was accompanied by changes in the gene expression of molecular myocardial targets of mitochondrial dynamics, whereas the myocardia of db/dbcat mice exhibited higher levels of inflammation, endoplasmic reticulum (ER) stress and apoptosis. Oral administration of FTY720/Fingolimod prevented the development of DCM in vivo after 3 months of treatment in both db/db groups. In db/db mice such cardiac amelioration was mainly associated with a decreased gene expression of targets of myocardial mitochondrial dynamics. Conversely, the improved cardiac function in treated db/dbcat mice was mainly associated with a decrease in the relative abundance of myocardial of TNFα and NF-kB p65 in cell nuclei, and a decreased content of caspase 3-cleaved. Moreover, the gene expression of ER stress targets was also reduced in treated db/dbcat mice. The anti-inflammatory and anti-apoptotic effects found in vivo were further confirmed in vitro using human AC16 cardiomyocytes incubated with FTY720/Fingolimod. Conclusions: The db/db y db/dbcat mice showed signs of DCM. This cardiac phenotype was accompanied by increased circulating levels of Cer 18:0. In contrast with db/dbcat, myocardial dysfunction in db/db mice was not accompanied by changes in inflammation, ER stress, and apoptosis, but with signs of an altered mitochondrial dynamics. Oral administration of FTY720/Fingolimod prevented the development of DCM in both db/db mice groups. The latter was accompanied with an improved systemic inflammation; however, the improved myocardial function was only related to improved signs of inflammation and apoptosis only in the myocardia of treated db/dbcat mice.