Evaluación de sustancias bioactivas producidas por rizobacterias para el control del fitopatógeno del cultivo de arroz Burkholderia glumae

Abstract

Aquesta tesi doctoral se centra en la cerca d'alternatives per al maneig de fitopatògens del cultiu de l'arròs mitjançant l'ús de rizobacteri, mitjançant l'obtenció de substàncies bioactives. Inicialment, es va seleccionar la soca S13B3, aïllada de la rizòsfera de cultius d'arròs, per la seva capacitat de generar extractes bioactius amb percentatges d'inhibició per sobre del 50% davant de Burkholderia glumae. En general, els extractes de la soca S13B3 varen mostrar la major activitat, perfilant-se com una soca que pot respondre de manera adequada als canvis de condicions de cultiu (substrat) per a la generació de substàncies bioactives. Es va observar que sucres tipus disacàrids com la maltosa generen un increment en la bioactivitat dels metabòlits produïts per S13B3, però, la farina d'arròs és un substrat millor per a la producció d'extractes bioactius amb CI50 1,8 i 1,2 vegades menors que els obtinguts amb glucosa i maltosa, respectivament, mostrant el potencial d'aquesta font de carboni per generar substàncies bioactives. D'altra banda, les fonts de nitrogen orgàniques van afavorir l'obtenció d'extractes crus amb més activitat. Així l'extracte de llevat va permetre que la soca S13B3 generés els extractes crus amb més activitat durant els assaigs realitzats. De la mateixa manera, la farina de xachafruto va presentar un comportament similar limitant el creixement in vitro de B. glumae, generant CI50 de 0,27 mg/mL de mitjana.

Per altra banda, el procés d'optimització va permetre determinar que la farina d'arròs genera extractes crus amb més activitat, representades en valors de CI50 petites, mostrant una disminució de 1,71 vegades comparada amb les obtingudes abans de l'optimització, mentre que l'extracte de llevat i la farina de xafruit augmenten aquests valors. Finalment, es va realitzar una aproximació als metabòlits responsables de la bioactivitat dels extractes obtinguts emprant tècniques de ressonància magnètica nuclear (RMN) i cromatografia líquida acoblada a masses d'alta resolució (HRLC-MS), que van permetre establir que la naturalesa química del compost majoritari en la fracció bioactiva és un derivat indòlic, on l'optimització va permetre obtenir les condicions ideals perquè la soca S13B3 generi una producció més gran d'aquest tipus de metabòlits bioactius. Sumat a això, l'anàlisi genòmica va revelar que la soca S13B3 presenta una proximitat amb la soca Enterobacter cloacae i es van detectar gens responsables de la biosíntesi de metabòlits associats a la promoció del creixement de plantes, com ara sideròfors, triptòfan, així com la solubilització de fosfat i potassi. De la mateixa manera, es van detectar grups de gens associats a la biosíntesi de metabòlits secundaris com ara tiopèptids, pèptids no ribosomals (NRPS), siberòfors, poliens d'aril i híbrids de policètids i pèptids no ribosomals.

A manera de conclusió, aquesta Tesi Doctoral proporciona informació valuosa sobre les possibilitats ofertes per la microbiota de sòls arrossers i també obre la porta per entendre el possible rol de les substàncies generades per aquest tipus de microorganismes a l'ecologia del sòl.

Esta tesis doctoral se centra en la búsqueda de alternativas para el manejo de fitopatógenos del cultivo del arroz mediante el uso de rizobacteria, mediante la obtención de sustancias bioactivas. Inicialmente, se seleccionó la cepa S13B3, aislada de la rizósfera de cultivos de arroz, por su capacidad de generar extractos bioactivos con porcentajes de inhibición por encima del 50% frente a Burkholderia glumae. En general S13B3 mostró una mayor actividad en sus extractos, perfilándose como una cepa que puede responder de manera adecuada a los cambios de condiciones de cultivo (sustrato) para la generación de sustancias bioactivas. Se observó que azúcares tipo disacáridos como la maltosa generan un incremento en la bioactividad de los metabolitos producidos por S13B3, sin embargo, la harina de arroz es un mejor sustrato para la producción de extractos bioactivos con CI50 1,8 y 1,2 veces más bajas frente a la glucosa y la maltosa, respectivamente, mostrando el potencial de esta fuente de carbono para generar sustancias bioactivas. Por otra parte, las fuentes de nitrógeno orgánicas favorecieron la obtención de extractos crudos con mayor actividad. el extracto de levadura con los extractos, la cual permitió que la cepa S13B3 generara los extractos crudos con mayor actividad durante los ensayos realizados. Del mismo modo, la harina de chachafruto presentó un comportamiento similar limitando el crecimiento in vitro de B. glumae, generando CI50 de 0,27 mg/mL en promedio.

Sucesivamente, el proceso de optimización permitió determinar que la harina de arroz genera extractos crudos con mayor actividad, representadas en valores de CI50s pequeñas, mostrando una disminución de 1,71 veces comparada con las obtenidas antes de la optimización, mientras que el extracto de levadura y la harina de chachafruto aumentan dichos valores. Finalmente, se realizó una aproximación de los metabolitos responsables de la bioactividad de los extractos obtenidos empleando técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN) y cromatografía líquida acoplada a masas de alta resolución (HRLC-MS), que permitieron establecer que la naturaleza química del compuesto mayoritario en la fracción bioactiva es un derivado indólico, donde la optimización permitió obtener las condiciones ideales para que la cepa S13B3 genere una mayor producción de este tipo de metabolitos bioactivos. Sumado a lo anterior, el análisis genómico reveló que la cepa S13B3 presenta una cercanía con la cepa Enterobacter cloacae y se detectaron genes responsables de la biosíntesis de metabolitos asociados a la promoción del crecimiento de plantas, tales como sideróforos, triptófano, así como la solubilización de fosfato y potasio. Del mismo modo, se detectaron grupos de genes asociados a la biosíntesis de metabolitos secundarios como tiopéptidos, péptidos no ribosomales (NRPS), siberóforos, polienos de arilo e híbridos de policétidos y péptidos no ribosomales.

En conclusión, esta Tesis Doctoral proporciona una mirada a las posibilidades ofrecidas por la microbiota de suelos arroceros y también abre la puerta para entender el posible rol de las sustancias generadas por este tipo de microorganismos en la ecología del suelo.

This doctoral thesis focuses on the search for alternatives for the management of rice crop phytopathogens through the use of rhizobacteria, by obtaining bioactive substances. Initially, strain S13B3, isolated from the rhizosphere of rice crops, was selected for its capacity to generate bioactive extracts with inhibition percentages above 50% against Burkholderia glumae. In general, S13B3 showed greater activity in its extracts, emerging as a strain that can respond adequately to changes in culture conditions (substrate) for the generation of bioactive substances. It was observed that disaccharide-type sugars such as maltose generate an increase in the bioactivity of the metabolites produced by S13B3, however, rice flour is a better substrate for the production of bioactive extracts with CI50 1.8 and 1.2 times lower compared to glucose and maltose, respectively, showing the potential of this carbon source to generate bioactive substances. On the other hand, the organic nitrogen sources favored the obtaining of crude extracts with higher activity. the yeast extract with the extracts, which allowed strain S13B3 to generate the crude extracts with higher activity during the tests carried out. Similarly, the Erythrina edulis flour showed a similar behavior limiting the in vitro growth of B. glumae, generating CI50 of 0.27 mg/mL on average.

Subsequently, the optimization process allowed determining that rice flour generates crude extracts with higher activity, represented in small CI50s values, showing a 1.71-fold decrease compared to those obtained before optimization, while yeast extract and Erythrina edulis flour increase these values. Finally, an approximation of the metabolites responsible for the bioactivity of the extracts obtained was made using nuclear magnetic resonance (NMR) and high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HRLC-MS) techniques, which allowed establishing that the chemical nature of the majority compound in the bioactive fraction is an indole derivative, where optimization allowed obtaining the ideal conditions for strain S13B3 to generate a greater production of this type of bioactive metabolites. In addition to the above, genomic analysis revealed that strain S13B3 presents a similarity with Enterobacter cloacae and genes responsible for the biosynthesis of metabolites associated with the promotion of plant growth, such as siderophores, tryptophan, as well as phosphate and potassium solubilization, were detected. Similarly, groups of genes associated with the biosynthesis of secondary metabolites such as thiopeptides, non-ribosomal peptides (NRPS), siberophores, aryl polyenes and hybrids of polyketides and non-ribosomal peptides were detected.

In conclusion, this Doctoral Thesis provides a look at the possibilities offered by the microbiota of rice soils and also opens the door to understanding the possible role of substances generated by this type of microorganisms in soil ecology.