Estudi de la resposta immunitària en el vessament pleural maligne de pacients amb adenocarcinoma pulmonar

Abstract

El vessament pleural maligne (VPM) es defineix com l’acumulació significativa de líquid pleural acompanyat de cèl·lules tumorals. És una complicació clínica força freqüent associada al càncer de pulmó avançat; en particular, a l’adenocarcinoma. L’aparició del VPM es relaciona amb un mal pronòstic i els tractaments són més aviat pal·liatius. Malgrat disposar de diverses tècniques de diagnòstic, s’estima que al voltant del 20% dels casos queden sense diagnosticar o són classificats erròniament. L’anàlisi de la composició molecular i cel·lular del líquid pleural pot ser útil per a trobar nous marcadors que confereixin un diagnòstic més ràpid i acurat del VPM o ajudin a predir la progressió de la malaltia. El VPM constitueix un medi únic per estudiar les interaccions entre les cèl·lules tumorals i les cèl·lules del sistema immunitari. Hi ha evidències de l’increment de molècules antiinflamatòries en els VPM, com el TGF-B i la IL-10 suggerint un entorn immunosupressor. Els factors secretats per les plaquetes també juguen un paper important promovent el creixement i la disseminació tumoral.

L’objectiu general de la tesi ha estat caracteritzar a nivell cel·lular, molecular i funcional els VPMs per identificar molècules implicades en la modulació de la resposta immunitària, en especial aquells factors solubles derivats de la plaqueta. L’objectiu clínic ha estat determinar el valor diagnòstic i/o pronòstic dels factors immunomoduladors alterats en el VPM. Es van recollir líquids pleurals de pacients amb adenocarcinoma pulmonar (VPM; n=47) i líquids pleurals de pacients amb insuficiència cardíaca congestiva (IC) (vessaments pleurals benignes (VPB); n=25), aquest últim com a grup control. Per tal d’estudiar l’efecte del VPM sobre les funcions dels limfòcits T i dels neutròfils es va dissenyar un model de cultiu in vitro amb líquids pleurals que simulés el microambient tumoral del VPM.

Els resultats mostren que la composició molecular i les associacions entre els factors immunomoduladors dels VPs varien en funció de l’etiologia. Els VPMs estan enriquit en factors derivats de la plaqueta, com són el TGF-B, el PF4, la P-selectina i el VEGF, en comparació amb els VPBs. En particular, el PF4 es va veure implicat en la supressió de la resposta dels limfòcits T observada en els cultius amb VPMs. Concentracions pleurals elevades d’aquesta molècula es relacionaven amb una menor activació, proliferació, i activitat citotòxica dels limfòcits T CD4+ i CD8+. A més a més, els limfòcits T estimulats en presència de VPMs adquirien un fenotip antiinflamatori, amb un augment de la producció de IL-10. L’elevat contingut de PF4 dels VPMs provenia parcialment d’una major producció local per part de les cèl·lules del líquid pleural, inclosos els limfòcits T activats, tot i no ser-ne la font principal. Malgrat no detectar un nombre significatiu de plaquetes, no es descarta que la principal via d’entrada puguin ser les micropartícules derivades de la plaqueta.

Pel que fa als neutròfils, el microambient tumoral del VPM estimulava l’activitat protumoral d’aquesta cèl·lula promovent la desgranulació i la NETosi, mentre que frena l’esclat oxidatiu en comparació amb els VPBs. La NETosi es va associar positivament amb la concentració pleural de P-selectina i PD-L1 soluble en VPMs indicant la participació dels factors derivats de la plaqueta en la modulació de l’activitat del neutròfil. La concentració dels productes de desgranulació (MPO, lactoferrina i MMP-9) i IL-8, eren més elevades en VPMs i permetien distingir-los dels VPBs, convertint-los en possibles marcadors de diagnòstic. Clínicament, la concentració pleural de PF4 i la capacitat del VPM d’induir la NETosis van resultar útils com a variables independents predictores de la supervivència dels pacients amb VPM derivat d’adenocarcinoma pulmonar. En ambdós casos, valors elevats s’associaven a un mal pronòstic.

El derrame pleural maligno (DPM) se define como la acumulación significativa de líquido pleural acompañado de células tumorales. Es una complicación clínica bastante frecuente asociada al cáncer de pulmón avanzado; en particular, al adenocarcinoma. La aparición del DPM se relaciona con un mal pronóstico y los tratamientos son mayoritariamente paliativos. A pesar de disponer de diversas técnicas de diagnóstico, se estima que en torno al 20% de los casos quedan sin diagnosticar o son erróneamente clasificados. El análisis de la composición molecular y celular del líquido pleural puede ser útil para encontrar nuevos marcadores que confieran un diagnóstico más rápido y preciso del DPM o ayuden a predecir la progresión de la enfermedad. El DPM constituye un medio único para estudiar interacciones entre las células tumorales y las células del sistema inmunitario. Existen evidencias del incremento de moléculas antiinflamatorias en los DPM, como el TGF-B y la IL-10, sugiriendo un entorno inmunosupresor. Los factores secretados por las plaquetas también juegan un papel importante promoviendo el crecimiento y diseminación tumoral.

El objetivo general de la tesis ha sido caracterizar a nivel celular, molecular y funcional los DPMs para identificar moléculas implicadas en la modulación de la respuesta inmunitaria, especialmente aquellos factores solubles derivados de la plaquita. El objetivo clínico ha sido determinar el valor diagnóstico y/o pronóstico de los factores inmunomoduladores alterados en el DPM. Se recogieron líquidos pleurales de pacientes con adenocarcinoma pulmonar (DPM; n=47) y líquidos pleurales de pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva (IC) (derrames pleurales benignos (DPB); n=25), este último como grupo control. Para estudiar el efecto del DPM sobre las funciones de los linfocitos T y de los neutrófilos se diseñó un modelo de cultivo in vitro con líquidos pleurales que simulara el microambiente tumoral del VPM.

Los resultados muestran que la composición molecular y las asociaciones entre los factores inmunomoduladores de los DPs varían en función de la etiología. Los DPMs están enriquecidos en factores derivados de la plaqueta, como son el TGF-β, el PF4, la P-selectina, y el VEGF, en comparación con los DPBs. En particular, el PF4 se vio implicado en la supresión de la respuesta de los linfocitos T observada en los cultivos con DPMs. Concentraciones pleurales elevadas de esta molécula se relacionaban con una menor activación, proliferación y actividad citotóxica de los linfocitos T CD4+ y CD8+. Además, los linfocitos T estimulados en presencia de DPMs adquirían un fenotipo antiinflamatorio, con un aumento de la producción de IL-10. El elevado contenido de PF4 de los VPM provenía parcialmente de una mayor producción local por parte de las células del líquido pleural, incluidos los linfocitos T activados, a pesar de no ser su fuente principal. Pese a no detectar un número significativo de plaquetas, no se descarta que la principal vía de entrada puedan ser las micropartículas derivadas de la plaqueta.

En cuanto a los neutrófilos, el microambiente tumoral del DPM estimulaba la actividad protumoral de esta célula promoviendo la desgranulación y la NETosis, mientras que frenaba el estallido oxidativo en comparación con los DPBs. La NETosis se asoció positivamente con la concentración pleural de P-selectina y PD-L1 soluble en DPMs indicando la participación de factores derivados en gran medida de la plaqueta en la modulación de la actividad del neutrófilo. La concentración de los productos de desgranulación (MPO, lactoferrina y MMP-9) e IL-8, eran más elevadas en DPMs y permitían distinguirlos de los DPBs, convirtiéndolos en posibles marcadores de diagnóstico. Clínicamente, la concentración pleural de PF4 y la capacidad del DPM de inducir la NETosis se asociaron independientemente con un un mal pronóstico en pacientes con DPM derivado de adenocarcinoma pulmonar.

Malignant pleural effusion (MPE) is defined as the significant accumulation of pleural fluid accompanied by tumor cells. It is a common complication associated with advanced lung cancer; in particular, adenocarcinoma. It is related to a poor prognosis and treatments are rather palliative. Despite having several diagnostic techniques, it is estimated that around 20% of cases remain undiagnosed or are misclassified. The analysis of the molecular and cellular composition of the pleural fluid can be useful to discover new biomarkers that confer a more accurate diagnosis of MPE or predict the progression of the disease. The MPE constitutes a unique milieu for studying the interactions between tumor and immune cells. There is evidence of increased anti-inflammatory molecules in MPE, such as TGF-B and IL-10, suggesting an immunosuppressive environment. Factors secreted by platelets also play an important role in promoting tumor growth and dissemination.

The main aim of the thesis was to characterize MPE at a cellular, molecular and functional level to identify molecules involved in the modulation of the immune response, especially those soluble factors derived from platelets. The clinical aim was to determine the diagnostic and/or prognostic value of altered immunomodulatory factors in MPE. We collected pleural fluids from lung adenocarcinoma patients (MPE; n=47) and pleural fluids from patients with congestive heart failure (HF) (benign pleural effusions (BPEs); n=25), as a control group. To study the effect of MPE on T lymphocyte and neutrophil functions, we designed an in vitro culture model with pleural fluids to simulate the MPE tumor microenvironment.

The results showed that molecular composition and associations between the immunomodulatory factors of the pleural fluids vary depending on the etiology. MPE is enriched in platelet-derived factors, such as TGF-B, PF4, P-selectin, and VEGF, compared to BPEs. We observed that PF4 was implicated in the suppression of the T lymphocyte response observed in MPE cultures. High pleural levels of this molecule were related to lower activation, proliferation, and cytotoxic activity of CD4+ and CD8+ T lymphocytes. In addition, T lymphocytes stimulated in the presence of VPMs acquired an anti-inflammatory phenotype, with increased IL-10 production. The high PF4 content of MPE was partially due to increased local production by pleural fluid cells, including activated T lymphocytes, although they weren’t the main source. Despite not detecting a significant number of platelets, it cannot be ruled out that platelet microparticles could be the main route of entry.