Aplicació a la pràctica clínica de la determinació prenatal no invasiva del genotip RHD fetal durant el primer trimestre de la gestació en gestants RhD negatives

Abstract

L’al·loimmunització contra l’antigen RhD eritrocitari és la causa més freqüent de malaltia hemolítica feto neonatal (MHFN) i la incompatibilitat RhD afecta aproximadament a un 12% de les parelles del nostre medi. Actualment, totes les gestants RhD negatiu estàn sotmeses a un programa d’immunoprofilaxis universal basat en l’administració de la gammaglobulina anti-D amb l’objectiu de prevenir la MHFN. No obstant, és important recordar que fins al 40% de les gestants RhD negatiu són portadores de fetus RhD negatiu que fan innecessària la immunoprofilaxis, evitant així no només el seu cost, sino també l’exposició als potencials riscos biològics del producte. Al 1997, Lo i els seus col·laboradors van demostrar que al voltant del 3-6% de l’ADN que circula lliure al plasma de les gestants és d’origen fetal. Després d’aquest descobriment es va obrir un ampli camp d’investigació conegut amb el nom de diagnòstic prenatal no invasiu (NIPD) i, de fet, la determinació del genotip RHD fetal a plasma matern de les gestants RhD negatiu va ser una de les seves primeres aplicacions a la pràctica clínica. La possibilitat de conèixer el genotip RHD fetal a partir d’una mostra de plasma matern és probablement l’avenç més important a la història d’aquesta malaltia (MHFN), després de la introducció de la profilaxi amb la gammaglobulina anti-D. Malgrat que fins a l’actualitat es disposava d’una àmplia experiència en la determinació del genotip RHD fetal no invasiu en el cas de les gestants al·loimmunitzades, no ha estat fàcil intentar establir un programa de cribatge RHD fetal per a indicar una immunoprofilaxis dirigida. La majoria dels estudis publicats fins ara s’han realitzat a partir de mostres sanguínies obtingudes durant el segon i tercer trimestre, donat que la quantitat de cffDNA augmenta a mesura que augmenta l’edat gestacional. Nosaltres, en canvi, hem realitzat el nostre estudi a partir de mostres de plasma obtingudes al primer trimestre. Al Gener del 2013 es va posar en marxa una guia de pràctica clínica per part del Servei de Ginecologia i Obstetrícia de l’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau en col·laboració amb el Banc de Sang i Teixits de Barcelona amb l’objectiu d’evaluar la sensibilitat i la especificitat del mètode de determinació del genotipat RHD fetal realitzat en plasma pertanyent a gestants RhD negatiu durant el primer trimestre. El genotip RHD fetal es va determinar fent servir la tècnica de PCR a temps real en un anàlisi TaqMan que analitzava dos seqüències del gen RHD, una seqüència a l’exó 5 i una altra a l’exó 10. Com a marcador addicional per a detectar la presència de cffDNA es va fer servir el gen SRY. La sensibilitat obtinguda va ser del 99.66% (IC 95% (98.82-100) amb una taxa de falsos negatius del 0.34% (inferior al reportat per altres estudis) i la de falsos positius del 1.19%. La especificitat va ser 98.81% (IC 95% (96.87-100)). Així doncs, tenint en compte els resultats obtinguts, l’aplicació de la nostra guia de pràctica clínica de forma universal evitaria l’administració innecessària al 36.09% de mares RhD negatiu no isoimmunitazades. La nostra aproximació al cost/benefici d’aquesta tècnica indica que és possible la seva implementació a la pràctica clínica habitual sense un increment significatiu del cost del programa preventiu. En resum, els resultats obtinguts demostren que els fetus de les gestants RhD negatiu poden ser genotipats a l’inici de la gestació amb una elevada fiabilitat, el que ens aboca a afirmar que probablement estem en condicions d’acceptar la determinació del genotip RHD fetal prenatal no invasiu com a un test segur i fiable per a dur a terme la seva implementació a la pràctica clínica habitual.

La aloinmunización contra el antígeno RhD eritrocitario es la causa más frecuente de enfermedad hemolítica fetal y neonatal (EHFN) y la incompatibilidad RhD afecta a aproximadamente un 12% de las parejas de nuestro medio. Actualmente, las gestantes RhD negativo siguen un programa de inmunoprofilaxis universal basado en la administración de gammaglobulina anti-D con el objetivo de prevenir la EHFN. Sin embargo, es importante recordar que hasta el 40% de las gestantes RhD negativo son portadoras de fetos RhD negativo siendo innecesaria en estos casos la administración de la inmunoprofilaxis, evitando así no sólo el coste de su administración, sino también la exposición a potenciales riesgos biológicos del producto. En 1997, Lo y sus colaboradores demostraron que alrededor del 3-6% del ADN que circula libre en el plasma de las gestantes es de origen fetal. Después de este descubrimiento se abrió un amplio campo de investigación conocido con el nombre de diagnóstico prenatal no invasivo (NIPD) y, de hecho, la determinación del genotipo RhD fetal en plasma materno de las gestantes RhD negativo fue una de sus primeras aplicaciones en la práctica clínica. La posibilidad de determinar el genotipo RHD fetal a partir de una muestra de plasma materno es probablemente el avance más importante en la historia de esta enfermedad (EHFN) tras la introducción de la inmunoprofilaxis con gammaglobulina anti-D. A pesar de que en la actualidad se disponía de una amplia experiencia en la determinación del genotipo RHD fetal no invasivo en el caso de las gestantes aloinmunizadas, no ha sido fácil intentar establecer un programa de cribaje RHD fetal para indicar la inmunoprofilaxis dirigida. La mayoría de los estudios publicados hasta ahora se han realizado a partir de muestras sanguíneas obtenidas durante el segundo y tercer trimestre, dado que la cantidad de cffDNA aumenta a medida que aumenta la edad gestacional. Nosotros, en cambio, hemos realizado nuestro estudio a partir de muestras de plasma obtenidas en el primer trimestre. En Enero de 2013 se puso en marcha una guía de práctica clínica por parte del Servicio de Ginecología y Obstetricia del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau en colaboración con el Banc de Sang i Teixits de Barcelona con el objetivo de evaluar la sensibilidad y la especificidad del método de determinación del genotipado RHD fetal realizado en plasma de gestantes RhD negativo durante el primer trimestre. El genotipo RHD fetal se determinó mediante la técnica de PCR a tiempo real en un análisis TaqMan que analizaba dos secuencias del gen RHD, una secuencia en el exón 5 y otra en el exón 10. Como marcador adicional para detectar la presencia de cffDNA se utilizó el gen SRY. La sensibilidad obtenida fue del 99,66% (98.82-100) con una tasa de falsos negativos del 0.34% (inferior al informado por otros estudios) y de falsos positivos del 1.19%. La especificidad fue del 98,81% (96.87-100). Así pues, teniendo en cuenta los resultados obtenidos, la aplicación de nuestra guía de práctica clínica de forma universal evitaría la administración innecesaria al 36.09% de las madres RhD negativo no isoinmunizadas. Nuestra aproximación al coste/beneficio de esta técnica indica que es posible su implementación en la práctica clínica habitual sin un incremento significativo del coste del programa preventivo. En resumen, los resultados obtenidos demuestran que los fetos de las gestantes RhD negativo pueden ser genotipados al inicio de la gestación con una elevada fiabilidad, lo que nos conduce a afirmar que probablemente estemos en condiciones de aceptar la determinación del genotipo RHD fetal prenatal no invasivo como un test seguro y fiable para llevar a cabo su implementación en la práctica clínica habitual.

Alloimmunization against the erythrocyte RhD antigen is the most common cause of fetal and neonatal hemolytic disease (FNHD) and RhD incompatibility affects approximately 12% of couples in our setting. Currently, RhD negative pregnant women follow a universal immunoprophylaxis program based on the administration of anti-D gamma globulin to prevent EHFN. However, it is important to remember that up to 40% of RhD-negative pregnant women are carriers of RhD-negative fetuses, in which case the administration of immunoprophylaxis is unnecessary, thus avoiding not only the cost of its administration, but also exposure to potential risks biological of the product. In 1997, Lo and colleagues showed that about 3-6% of the DNA circulating freely in the plasma of pregnant women is of fetal origin. After this discovery, a wide field of research known as non-invasive prenatal diagnosis (NIPD) was opened and, in fact, the determination of the fetal RhD genotype in maternal plasma of RhD-negative pregnant women was one of its first clinical applications practice. The possibility of determining the fetal RHD genotype from a maternal plasma sample is probably the most important advance in the history of this disease (HFN) after the introduction of immunoprophylaxis with anti-D gamma globulin. Although there is now extensive experience in non-invasive fetal RHD genotyping in alloimmunized pregnant women, it has not been easy to attempt to establish a fetal RHD screening program to indicate targeted immunoprophylaxis. Most of the studies published to date have been performed from blood samples obtained during the second and third trimesters, since the amount of cffDNA increases with increasing gestational age. We, on the other hand, have carried out our study using plasma samples obtained in the first trimester. In January 2013, the Gynecology and Obstetrics Service of the Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, in collaboration with the Banc de Sang i Teixits de Barcelona, ​​launched a clinical practice guide with the aim of evaluating the sensitivity and specificity of fetal RHD genotyping method performed on plasma of RhD negative pregnant women during the first trimester The fetal RHD genotype was determined by real-time PCR in a TaqMan assay that analyzed two sequences of the RHD gene, one sequence in exon 5 and another in exon 10. An additional marker to detect the presence of cffDNA was used. the SRY gene. The sensitivity obtained was 99.66% (98.82-100) with a false negative rate of 0.34% (lower than that reported by other studies) and a false positive rate of 1.19%. The specificity was 98.81% (96.87-100). Thus, taking into account our results, the universal application of our clinical practice guideline would avoid unnecessary administration to 36.09% of non-isoimmunized RhD-negative mothers. Our approach to the cost/benefit of this technique indicates that it is possible to implement it in routine clinical practice without a significant increase in the cost of the preventive program. In conclusion, our results show that fetuses from RhD-negative pregnant women can be genotyped early in pregnancy with high reliability, leading us to state that we are probably in a position to accept non-invasive prenatal fetal RHD genotyping as a safe and reliable test to carry out its implementation in routine clinical practice.