Análisis proteómico y bioquímico del regulador autoinmune: nuevas funcionalidades y vías de degradación de aire

Abstract

El timus és l’òrgan on es genera el repertori de limfòcits T que circularan per perifèria. Per tal que aquest repertori sigui immunocompetent, és a dir, prou divers per al reconeixement de tots els patògens existents i sigui mínimament autoreactiu, es requereix una selecció exhaustiva al timus. La tolerància central evita en gran mesura la maduració dels limfòcits T amb potencial autoreactiu. Aquesta consisteix en l’eliminació de timòcits autoreactius durant la selecció tímica per dos processos: una selecció tímica positiva a la escorça, on sobreviuran timòcits que puguin reconèixer molècules pròpies del Complex Major d’Histocompatibilitat (MHC) associades amb pèptids propis; i d’una subseqüent selecció negativa a la medul·la, en que s’eliminaran aquells que reconeixin complexos MHC-pèptid propis amb alta afinitat. Perquè la selecció negativa sigui eficient serà necessària l’expressió del proteoma complet de l’organisme. El Regulador Autoimmune (AIRE) és la proteïna encarregada de dirigir la major part de l’expressió ectòpica d’antígens restringits a teixits i òrgans (TRAs) per part de les cèl·lules epitelials tímiques (mTECs), on és expressat majoritàriament. AIRE és una proteïna multi-domini relacionada amb la regulació de l’expressió transcripció gènica, apoptosi, diferenciació cel·lular i, fins i tot, cicle cel·lular. Mutacions al gen d’AIRE provoquen l’anomenada Poliendocrinopatia Autoimmune de tipus 1 (APS-1), malaltia autoimmune monogènica i poli-orgànica, que cursa habitualment amb autoanticossos en sang i infiltrats limfocitaris a causa d’irregularitats al procés de tolerància central. Prèviament, el nostre grup va identificar diferències a nivell proteòmic en comparar cèl·lules que expressen AIRE amb d’altres que no. Aquelles cèl·lules que expressaven AIRE, van presentar un augment en l’expressió de proteïnes pro-apoptòtiques amb una consegüent inducció de l’apoptosi, respecte de les cèl·lules control. Calcyclin-Binding Protein o SIAH1 Interacting Protein (CACYBP/SIP) va ser identificada com una de les proteïnes incrementades, la qual és una proteïna adaptadora que desenvolupa activitats relacionades amb degradació via ubiquitina-proteasoma. A la seva seqüència, es troba l’anomenat motiu d’interacció amb Seven in Absentia Homolog 1 (SIAH1), una E3 ubiquitina lligasa de tipus RING. Aquesta família té dos membres catalíticament funcionals: SIAH1 i SIAH2. Totes dues són regulades en resposta a diferents senyals: SIAH1 és expressada en resposta a dany genotòxic i, SIAH2, en resposta a hipòxia. Aquestes E3 ubiquitina lligases comparteixen alguns substrats específics, part dels quals estan relacionats amb AIRE. Una anàlisi de seqüència proteica d’AIRE va permetre identificar la presència de dos motius d’interacció amb SIAH1: un complet i un altre amb una mutació conservadora. A aquesta tesi s’han caracteritzat, mitjançant tècniques bioquímiques i proteòmica quantitativa, alguns aspectes relacionats amb la proteïna AIRE i l’efecte de la seva expressió a línies cel·lulars que puguin permetre trobar-hi noves funcions de la proteïna. En primer lloc, s’han comparat, per mitjà de tècniques de proteòmica quantitativa (iTRAQ) i d’anàlisi de repertoris de pèptids derivats d’HLA-I, els proteomes i els peptidomes de cèl·lules que expressaven AIRE de manera diferencial, respectivament. Aquest tipus d’estudi no s’havia realitzat fins ara. De manera addicional, s’han mapejat els dominis d’AIRE implicats en apoptosi. A més, aquesta aproximació ha permès identificar la relació de l’expressió d’AIRE amb un increment de la mobilitat cel·lular. En segon lloc, s’ha caracteritzat una nova localització de la proteïna en cèl·lules post-mitòtiques, a prop del midbody. També s’ha aconseguit mostrar la localització d’AIRE durant tot el cicle cel·lular i, més concretament, a les diferents fases de la mitosi. En últim lloc, s’ha caracteritzat bioquímicament i funcionalment la interacció entre AIRE i les E3 ubiquitina lligases de la família de SIAH, mostrant que AIRE interacciona amb SIAH1 i SIAH2 a través del primer motiu d’interacció. Aquesta interacció permet la ubiquitinació d’AIRE i la seva degradació. Aquest efecte és més notori amb SIAH1.

El timo es el órgano donde se genera el repertorio de linfocitos T que circulará por la periferia. Para que este repertorio sea inmunocompetente y mínimamente autorreactivo se requiere una selección exhaustiva en el timo. La tolerancia central evita en gran medida la maduración de linfocitos T con potencial autorreactivo. Consiste en la eliminación de timocitos autorreactivos durante la selección tímica a través de dos procesos: una selección positiva en la corteza, donde sobrevivirán timocitos que logren reconocer moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) propias asociados a péptidos propios; y de una selección negativa en la médula, que eliminará aquellos que reconozcan complejos MHC-péptido propios con alta afinidad. Para que la selección negativa sea eficiente será necesaria la expresión de todas las proteínas presentes en el organismo. El Regulador Autoinmune (AIRE) es la proteína encargada de dirigir gran parte de la expresión ectópica de antígenos restringidos a tejidos y órganos (TRAs) por parte de las células epiteliales tímicas medulares (mTECs), donde se expresa mayoritariamente. AIRE es una proteína multidominio relacionada con la regulación de la expresión y transcripción génica, apoptosis, diferenciación celular e incluso ciclo celular. Mutaciones en el gen de AIRE provocan la denominada Poliendocrinopatía Autoinmune de tipo 1 (APS-1), enfermedad autoinmune monogénica y poliorgánica, cursando habitualmente con autoanticuerpos en sangre e infiltrados linfocitarios debido a irregularidades en el proceso de tolerancia central. En un trabajo previo de nuestro grupo se determinaron diferencias a nivel proteómico comparando células que expresaban AIRE con las que no. Aquellas células que expresaban AIRE presentaban un aumento en la expresión de proteínas pro-apoptóticas con una consecuente inducción en la apoptosis respecto a las células control, así como un incremento en proteínas de tipo chaperona y una disminución de proteínas relacionadas con el citoesqueleto. Entre las proteínas incrementadas se encontró la Calcyclin-Binding Protein o SIAH1-Interacting Protein (CACYBP/SIP). Es una proteína adaptadora que contiene un motivo de unión a una E3 ubiquitín ligasa, Seven In Absentia Homologe 1 (SIAH1). SIAH1 pertenece a una familia de E3 ubiquitín ligasas de tipo RING. Posee tres miembros, dos de ellos catalíticamente funcionales: SIAH1 y SIAH2 que presentan una elevada similitud de secuencia pero con actividades antagónicas. SIAH1 es pro-apoptótica y SIAH2 pro-oncogénica. Su regulación está determinada en respuesta a señales de daño genotóxico e hipoxia, respectivamente. Ambas proteínas comparten sustratos, presentando algunos de ellos relación con la proteína AIRE. Un análisis de la secuencia proteica de AIRE permitió observar que la proteína contenía dos posibles motivos de unión a SIAH1, uno completo y otro con una mutación conservadora. En la presente tesis se han caracterizado, mediante técnicas bioquímicas y de proteómica cuantitativa, varios aspectos relacionados con AIRE y el efecto de su expresión en líneas celulares, que han permitido encontrar nuevas posibles funciones de la proteína: En primer lugar, se han comparado mediante técnicas de proteómica cuantitativa (iTRAQ) los proteomas de células que expresaban AIRE de forma diferencial y se han comparado los peptidomas de HLA-I de las mismas células, estudio que no se había realizado hasta el momento. Adicionalmente se han mapeado los dominios de AIRE para inducir apoptosis. Finalmente, esta aproximación ha permitido mostrar que AIRE induce un incremento en la movilidad celular. En segundo lugar, se ha caracterizado una nueva localización de la proteína AIRE en células post-mitóticas, cerca del midbody. Asimismo, se ha logrado mostrar la localización de AIRE a lo largo del ciclo celular y, más concretamente, en las diferentes fases de la mitosis; En último lugar, se ha caracterizado bioquímica y funcionalmente la interacción entre AIRE, SIAH1 y SIAH2 a través del primer motivo de interacción, permitiendo su poli-ubiquitinación y degradación.

The thymus is the organ where the repertoire of circulating T lymphocytes is generated. An exhaustive selection whitin the thymus is required in order to generate an immunocompetent T cell repertoire: broadly diverse for recognizing pathogens but minimally autoreactive. Central tolerance is based on the successfully maturation of T cells by an appropriate interaction with self Major Histocompatibility Complex (MHC)/peptide complexes. This process consists in a positive selection which takes place in the cortex and a negative selection carried out in the thymic medulla. In the cortex, only thymoctes carrying a functional TCR able to recognize self MHC molecules will survive. In the medulla, thymocytes that recognize self MHC/peptides complexes are eliminated. For negative selection to be efficient it will be necessary the expression of the whole proteome of the body. The Autoimmune Regulator (AIRE) leads the ectopic expression of antigens restricted to tissues and organs (TRAs) by medullary thymic epithelial cells (mTECs). AIRE is a multidomain protein related to the regulation of gene expression and transcription, apoptosis, cell differentiation and cell cycle. Mutations in AIRE gene cause the so-called Autoimmune Polyendocrinopathy type 1 (APS-1), a monogenic and polyorganic autoimmune disease, characterized by the presence of autoantibodies in the blood and lymphocytic infiltrates due to a defective central tolerance process Previous findings of our group showed differences between the proteomes of differentially AIRE expressing cells. AIRE+ cells increased the expression of chaperones and apoptosis-related proteins and dampened cytoskeleton-associated proteins compared to control cells. One of the increased proteins was Calcyclin-Binding Protein or SIAH1-Interacting Protein (CACYBP/SIP), an adaptor protein involved in ubiquitin-proteasome mediated protein degradation. SIP interacts with Seven in Absentia Homologue 1 (SIAH1) E3 ubiquitin ligase through the SIAH1 binding motif. SIAH1 and SIAH2 belongs to SIAH RING-type E3 ubiquitin ligase family. SIAH1 is expressed in response to genotoxic damage while SIAH2 is increased under hypoxia conditions. Both E3 ubiquitin ligases share specific targets, some of them related with AIRE. Protein sequence analysis showed the presence of two possible SIAH1 binding motifs in AIRE sequence: one with the complete sequence and the other with a conservative mutation. In this thesis, some aspects related to AIRE and the effect of its expression in cell lines have been characterized using biochemical and proteomics techniques, which may allow us to find new functions of the protein: First, using quantitative proteomics techniques (iTRAQ) and HLA-I derived peptides repertoire analysis the proteomes and the peptidomes of differentially AIRE expressing cells have been analyzed. A study that had not been carried out up to now. Additionally, the AIRE domains involved in apoptosis have been identify. Finally, this approach has allowed us to show that AIRE induces an increase in cell mobility. Second, a new localization of the AIRE protein has been characterized in post-mitotic cells, surrounding the midbody. Likewise, it has been possible to show the location of AIRE throughout the cell cycle and in different mitotic phases. Third the interaction between AIRE and the E3 ubiquitin ligases of the SIAH family has been biochemically and functionally characterized. AIRE interacts with SIAH1 and SIAH2 through the first interaction motif. SIAH1 leads to the polyubiquitination and degradation of AIRE. That effect is slightly observed in the case of SIAH2 although polyubiquitinated AIRE is also detected.