The microbiome and vector mosquitoes: New Insights for Malaria and Arbovirus Control and Surveillance

Abstract

A Europa, l’amenaça del ressorgiment i introducció de malalties transmeses per mosquits, com la malària i la febre de la vall del Rift, ha despertat un nou interès en l’estudi del microbioma associat amb mosquits autòctons per a una millor comprensió de les interaccions mosquit–patogen amb la finalitat de desenvolupar eines de vigilància vectorial i control ecològicament més adequades - En conseqüència, la tesi present es va enfocar en i) explorar la microbiota de l’Anopheles atroparvus, ii) avaluar la influencia de flavivirus insecto-específic en la competència vectorial del Culex pipiens i de l’Aedes vexans d’ Europa per a la transmissió de RVFV, i iii) Aplicar metagenòmica a targetes FTA com a nou mètode per a la detecció de virus i vigilància d’arbovirus. Al primer capítol, es va establir una colònia de laboratori d’ An. atroparvus del Delta de l’ Ebre i es va actualitzar el seu protocol de cria. El seqüènciament del gen bacterià 1S rRNA va mostrar que l’ambient de cria, fisiologia i hàbits de farratge va influir en la microbiota tant de mosquits de camp com de laboratori. Addicionalment, els anàlisis de diversitat van mostrar variació entre els diferents estadis de desenvolupament silvestres i un declivi de la diversitat en el grup de femelles de la desena generació de laboratori F10, tot i això, van conservar una fracció significativa de la microbiota de les femelles silvestres. Finalment, proteobactèries Gram-negatives van predominar en la microbiota de l’ An. atroparvus, entre les quals Pseudomonas, Asaia i Serratia van ser identificades com a candidates potencials per al control vectorial local. Per avaluar la influencia de ISFVs en la competència vectorial enfront de la transmissió de RVFV (Capítol 2), primer es va estudiar la infecció de Culex flavivirus (CxFV) a Cx. Pipiens a través d’exposició oral i inoculació intratoràcica. CxFV va infectar a Cx. Pipiens després d’inoculacions intratoràciques però no a través de l’exposició oral. Posteriorment, els assajos de competència vectorial enfront de RVFV es van realitzar en co-infecció amb CxFV i un flavivirus de mosquit de circulació natural, respectivament, en Cx. pipiens i Ae. vexans. Ambdues poblacions locals van mostrar ser competents per a RVFV després d’exposició oral. Per altra banda, ni CxFV ni RVFV van interferir en la seva respectiva infecció, mentre que el flavivirus de mosquit de circulació natural va modular la susceptibilitat d’infecció amb RVFV en Ae. vexans, suggerint el seu potencial ús com agent biològic per a la prevenció de la transmissió de RVFV. Finalment, per a avaluar noves alternatives per a la detecció de virus circulants i vigilància d’arbovirus (Capítol 3), targetes FTA amb esquer de mel van ser exposades a mosquits capturats en el camp durant jornades de vigilància entomològica per a la seva posterior anàlisi mitjançant seqüenciació de nova generació. Virus associats a artròpodes i plantes van ser identificats en les FTAs i es van obtenir genomes virals gairebé complets, el que suggereix una bona preservació d’ ARN viral. Per a confirmar la presència de virus associats amb mosquits en els espècimens capturats, els pools de mosquits van ser analitzats utilitzant PCR de transcripció reversa i primers espècie-específics dissenyats a partir de les seqüències obtingudes de les FTAs. Virus relacionats amb Alphamesonivirus, Quaranjavirus i Bunyavirales no classificats van ser detectats en mosquits de Catalunya constituent el primer registre de distribució d’aquests virus en mosquits europeus. La detecció d’ ISVs a la saliva de mosquits de forma silvestre demostra la viabilitat d’aquest mètode per a fer monitoreig de la fracció transmissible del viroma de mosquits i a seva utilitat en la vigilància d’arbovirus.

En Europa, la amenaza del resurgimiento e introducción de enfermedades transmitidas por mosquitos, como la malaria y la fiebre del Valle de Rift, ha despertado un nuevo interés en el estudio del microbioma asociado con mosquitos autóctonos para un mejor entendimiento de las interacciones mosquito-patógeno con el fin de desarrollar herramientas de vigilancia vectorial y control ecológicamente más adecuadas. Consecuentemente, la presente tesis se enfocó en: i) explorar la microbiota de Anopheles atroparvus, ii) evaluar la influencia de flavivirus insecto-específico en la competencia vectorial de Culex pipiens y Aedes vexans de Europa para la transmisión de RVFV, y iii) Aplicar metagenómica en tarjetas FTA como un nuevo método para la detección de virus y vigilancia de arbovirus. En el primer capítulo, se estableció una colonia de laboratorio de An. atroparvus del Delta del Ebro y se actualizó su protocolo de cría. El secuenciamiento del gen bacteriano 16S rRNA mostró que el ambiente de cría, fisiología y hábitos de forrajeo influyeron en la microbiota de mosquitos tanto de campo como de laboratorio. Los análisis de diversidad mostraron variación entre los diferentes estadios de desarrollo silvestres y un declive de diversidad en hembras de la décima generación de laboratorio, sin embargo, una fracción significativa de la microbiota de hembras silvestres fue conservada. Finalmente, proteobacterias Gram-negativas predominaron en la microbiota de An. atroparvus, entre las cuales Pseudomonas, Asaia y Serratia fueron identificadas como candidatas potenciales para control vectorial local. Para evaluar la influencia de ISFVs en la competencia vectorial frente a la transmisión de RVFV (Capítulo 2), primero se estudió la infección de Culex flavivirus (CxFV) en Cx. pipiens a través de exposición oral e inoculación intratorácica. CxFV infectó a Cx. pipiens después de inoculaciones intratorácicas pero no a través de la exposición oral. Los ensayos de competencia vectorial frente a RVFV se realizaron en co-infección con CxFV y un flavivirus de mosquito de circulación natural, respectivamente, en Cx. pipiens y Ae. vexans. Ambas poblaciones mostraron ser competentes para RVFV después de exposición oral. Por otra parte, CxFV ni RVFV interfirieron con su respectiva infección, mientras que el flavivirus de mosquito moduló la susceptibilidad de infección con RVFV en Ae. vexans, sugiriendo su potencial uso como agente biológico para la prevención de la transmisión de RVFV. Finalmente, para evaluar nuevas alternativas para la detección de virus circulantes y vigilancia de arbovirus (Capítulo 3), tarjetas FTA con cebo de miel fueron expuestas a mosquitos capturados en el campo durante jornadas de vigilancia entomológica para su posterior análisis mediante NGS. Virus asociados a artrópodos y plantas fueron identificados en las FTAs y genomas virales casi completos fueron obtenidos, lo que sugiere una buena preservación de ARN viral. Para confirmar la presencia de virus asociados con mosquitos en los especímenes capturados, los pools de mosquitos fueron analizados usando RT-PCR y primers especie-específicos diseñados a partir de las secuencias obtenidas de las FTAs. Virus relacionados con Alphamesonivirus, Quaranjavirus y Bunyavirales no clasificados fueron detectados en mosquitos de Cataluña constituyendo el primer registro de distribución de estos virus en mosquitos europeos. La detección de ISVs en la saliva de mosquitos de forma silvestre demuestra la viabilidad de este método para monitorear la fracción transmisible del virroma de mosquitos y su utilidad en la vigilancia de arbovitus. El presente trabajo contribuye con información para un mejor entendimiento de los factores detrás de la estructura del microbioma de mosquitos locales y su potencial influencia en la competencia vectorial frente a arbovirus. Adicionalmente, provee un nuevo método para complementar la vigilancia de arbovirus en zonas susceptibles, así como, para la detección de nuevos virus circulantes y potencialmente patogénicos

The threat of the resurgence or introduction of mosquito-borne diseases, such as malaria and Rift Valley fever, into the European continent has awakened new interests in studying the microbiome associated to autochthonous mosquitoes for better understanding mosquito-pathogen interaction and developing ecologically adequate vector surveillance and control tools. Consequently, this thesis aimed to i) explore the microbiota of Anopheles atroparvus, a vector involved in malaria transmission in Europe, ii) assess the influence of insect-specific flaviviruses on the vector competence of European Culex pipiens and Aedes vexans for the transmission of RVFV, and iii) apply metagenomics on FTA cards as a new approach for virus detection and arbovirus surveillance. In the first chapter, a laboratory colony of An. atroparvus from the Ebro Delta was established, and its rearing protocol updated. Sequencing of the bacterial 16S rRNA gene showed that the breeding environment, physiology and foraging habits influenced the microbiota of field-caught and laboratory-colonized mosquitoes. Diversity analyses showed inter-sample variation among sylvan developmental stages and a diversity decline in adult females after ten-laboratory generations. Nonetheless, a significant fraction of the microbiota was conserved from wild-caught specimens until the tenth laboratory-generation. Environmentally acquired Gram-negative proteobacteria dominated the microbiota of this anopheles population, among which, Pseudomonas, Asaia and Serratia were identified as potential candidates to be studied for local vector control. To assess the influence of ISFVs on the vector competence for the transmission of RVFV (Chapter 2), the infection of Culex flavivirus (CxFV) was first studied in Cx. pipiens by oral exposure and intrathoracic inoculations. CxFV infected Cx. pipiens after intrathoracic inoculations but not after oral exposure. Then, RVFV vector competence assays in co-infection with CxFV and a mosquito-flavivirus of natural circulation were conducted in Cx. pipiens and Ae. vexans respectively. Both Catalonian species showed to be competent vectors for RVFV after oral exposure. CxFV nor RVFV interfered with each other’s infection, while, naturally infecting mosquito-flavivirus modulated RVFV infection susceptibility in Ae. vexans, suggesting its potential use as bio-agent for preventing RVFV transmission. Finally, to assess new alternatives for circulating viruses’ detection and arboviral surveillance (Chapter 3), next generation sequencing was applied on honey-baited FTA cards that were exposed to field-captured mosquitoes during entomological surveys. Arthropod- and plant-infecting viruses were identified on FTAs and near-complete viral genomes were obtained suggesting good quality preservation of viral RNAs. To confirm the presence of mosquito-associated viruses in the captured specimens, mosquito pools were screened using reverse-transcription PCRs and species-specific primers designed from the sequences obtained from the FTAs. Viruses related to Alphamesonivirus, Quaranjavirus and unclassified Bunyavirales were detected in Catalonian mosquitoes. These findings constitute the first distribution record of these insect-specific viruses in European mosquitoes. Detecting ISVs in mosquitoes’ saliva in field conditions demonstrate the feasibility of this approach to monitor the transmissible fraction of the mosquitoes’ virome and its suitability for arbovirus surveillance. Overall, the present work contributes with valuable information for better understanding the factors behind the structure of the microbiome of local vector mosquitoes, its potential influence in vector competence, and provides a new approach to complement arbovirus surveillance in susceptible areas and to detect circulating and new potentially pathogenic viruses.