The S. cerevisiae protein phosphatase Ppz1: unraveling the molecular basis of its toxicity and its connection with intracellular localization

Abstract

Els gens PPZ1 i PPZ2 de Saccharomyces cerevisiae codifiquen dues Ser/Thr fosfatases que només es troben en fongs. Els enzims Ppz tenen un domini catalític C-terminal molt conservat, relacionat amb el de la fosfatasa PP1c. Un tret característic de les fosfatases Ppz és la presència d’una regió N-terminal més divergent i desestructurada que no té relació amb l’enzim PP1c. Notablement, aquesta regió presenta una Gly-2 adequada per ser N-miristilada, una modificació que associa les proteïnes a la membrana plasmàtica. Ppz1 és més rellevant biològicament que Ppz2, i és un factor determinant de la homeòstasi catiònica, ja que: a) regula negativament l’import d’alta afinitat de K+ inhibint els transportadors Trk, el principal sistema d’import de K+ en llevats, i b) reprimeix l’expressió del gen ENA1, una Na+/K+-ATPasa. Ppz1 té dues subunitats reguladores negatives, Vhs3 i Hal3, essent l’últim el principal inhibidor. Aquestes subunitats reguladores s’uneixen al domini catalític de la fosfatasa i inhibeixen la seva activitat enzimàtica. Curiosament, la Ppz1 s’ha descrit com a la proteïna més tòxica per a les cèl·lules de llevat quan se sobre-expressa i la seva toxicitat s’ha demostrat que depèn de l’activitat enzimàtica. En aquest treball hem volgut contribuir a elucidar els mecanismes darrere de la toxicitat d’aquesta fosfatasa. Primerament, presentem diversos experiments que donen suport i expandeixen els assajos de transcriptòmica i fosfoproteòmica de cèl·lules que sobre-expressen Ppz1. En aquest treball mostrem com la sobre-expressió de Ppz1 comporta una acumulació d’espècies reactives d’oxigen, causa danys en el DNA i provoca alteracions en l’estat de fosforilació d’algunes proteïnes requerides per l’adaptació a baixa glucosa. En segon lloc, hem descrit que part de la toxicitat deguda a l’excés d’activitat Ppz1 està causada per una alteració de la homeòstasi de cations monovalents. No obstant, aquest efecte no derivaria del seu rol com a regulador negatiu dels transportadors de K+ Trk1/Trk2, sinó que seria degut a una hiperactivació de Nha1, un antiportador de Na+/H+ que es troba a la membrana plasmàtica, i, potser a la inhibició de la H+-ATPasa Pma1. Per últim, hem estudiat la localització cel·lular de Ppz1 en diferents condicions de sobre-expressió. Ppz1 es troba essencialment a la membrana plasmàtica, mentre que Hal3 mostra una localització citosòlica. Sorprenenment, hem descobert que la sobre-expressió de la fosfatasa nativa i de Hal3 alhora indueix la internalització d’ambdues proteïnes a la membrana vacuolar. També mostrem evidències de com la disrupció d’aquesta internalització bloca l’efecte beneficiós de sobre-expressar Hal3 en cèl·lules en les que se sobre-expresa Ppz1.

Los genes PPZ1 y PPZ2 de Saccharomyces cerevisiae codifican dos Ser/Thr fosfatasas que únicamente se encuentran en hongos. Las enzimas Ppz tienen un dominio catalítico C-terminal muy conservado, relacionado con el de la fosfatasa PP1c. Una característica de las fosfatasas Ppz1 es la presencia de una región N-terminal más divergente y desestructurada que no tiene relación con el enzima PP1c. Notablemente, esta región presenta una Gly-2 que puede ser N-miristilada, una modificación que asocia las proteínas a la membrana plasmática. Ppz1 es más relevante biológicamente que Ppz2, y es un factor determinante de la homeostasis catiónica, ya que: a) regula negativamente la entrada de alta afinidad de K+ inhibiendo los transportadores Trk, el principal sistema de captación de K+ en levadura, y b) reprime la expresión del gen ENA1, una Na+/K+-ATPasa. Ppz1 tiene dos subunidades reguladoras negativas, Vhs3 y Hal3, siendo el último el principal inhibidor. Estas subunidades reguladoras se unen al dominio catalítico de la fosfatasa e inhiben su actividad enzimática. Curiosamente, Ppz1 ha sido descrita como la proteína más tóxica para las células de levadura cuando se sobre-expresa y se ha demostrado que su toxicidad depende de su actividad enzimática. En este trabajo hemos querido contribuir en elucidar los mecanismos detrás de la toxicidad de esta fosfatasa. En primer lugar, presentamos distintos experimentos que respaldan y expanden los ensayos de transcriptómica y fosfoproteómica de células que sobre-expresan Ppz1. En este trabajo mostramos como la sobre-expresión de Ppz1 conlleva la acumulación de especies reactivas de oxígeno, causa daños en el DNA y provoca alteraciones en el estado de fosforilación de algunas proteínas necesarias para la adaptación a condiciones de baja glucosa. En segundo lugar, hemos descrito que parte de la toxicidad debida a un exceso de actividad Ppz1 está causada por una alteración de la homeostasis de cationes monovalentes. No obstante, este efecto no derivaría del papel como regulador negativo de los transportadores de K+ Trk1/Trk2, sino que sería debido a una hiperactivación de Nha1, un antiportador de Na+/H+ que se encuentra en la membrana plasmática, y, quizás a la inhibición de la H+-ATPasa Pma1. Por último, hemos estudiado la localización celular de Ppz1 en distintas condiciones de sobre-expresión. Ppz1 se encuentra esencialmente en la membrana plasmática, mientras que Hal3 presenta una localización citosólica. Sorprendentemente, hemos descubierto que al sobre-expresar simultáneamente la fosfatasa nativa y Hal3 se induce la internalización de ambas proteínas a la membrana vacuolar. También presentamos evidencias de como la disrupción de esta internalización bloquea el efecto beneficioso de sobre-expresar Hal3 en células que sobre-expresan Ppz1.

The PPZ1 and PPZ2 genes of Saccharomyces cerevisiae code for two Ser/Thr phosphatases that are only found in fungi. These Ppz enzymes have a highly conserved C-terminal catalytic domain, related to the PP1c phosphatase. One interesting feature of the Ppz phosphatases is the presence of a more divergent and unstructured N-terminal region, which is not found in PP1c enzymes. Remarkably, this N-terminal region has a Gly-2 that is suitable for N-myristoylation, a modification known to anchor proteins to the plasma membrane. Ppz1 is more biologically relevant than the Ppz2, and it is a crucial determinant of cation homeostasis, since it: a) negatively regulates high-affinity K+ import by inhibiting the Trk system, the major K+ import system in yeast cells, and b) represses the expression of the ENA1 gene, a P-type ATPase sodium pump. Ppz1 has two negative regulatory subunits, Vhs3 and Hal3, being the latter the major inhibitor. These regulatory subunits bind to the catalytic domain of the phosphatase and inhibit its enzymatic activity. Remarkably, Ppz1 has been described to be the most toxic protein for yeast cells when overexpressed and its toxicity was shown to be dependent on the enzymatic activity. In this work we aimed to elucidate the mechanism behind the toxicity of this phosphatase. Firstly, we present several experiments that support and extend data recently obtained by transcriptomic and phosphoproteomic assays of cells overexpressing Ppz1. We demonstrate here that Ppz1 overexpression results in the accumulation of reactive oxygen species, causes DNA damage, and provokes alterations in the phosphorylation state and intracellular localization of several proteins required for adaptation to low glucose. Second, we describe that part of the toxic effect of an excess of Ppz1 activity is caused by alteration in monovalent cation homeostasis. However, this effect would not derive from the known role in the regulation of Trk1/Trk2 K+ transporters, but from the hyperactivation of Nha1, a Na+/H+ antiporter found in the plasma membrane and perhaps from the inhibition of the Pma1 H+-ATPase. Lastly, we studied the subcellular localization of Ppz1-GFP in different overexpressing conditions. Ppz1 is essentially located at the plasma membrane, while Hal3 shows a cytosolic localization. Remarkably, we found that the overexpression of the native phosphatase and Hal3 induced the internalization of both proteins to the vacuolar membrane. We also present evidence that the disruption of this internalization blocks the beneficial effect of overexpressing Hal3 in cells where Ppz1 is overexpressed.