Dissection and modulation of isoprenoid biosynthesis in higher plants

Abstract

La meva tesi es centra en identificar i caracteritzar mitjançant enginyeria genètica, (introduint gens o editant el genoma) els mecanismes reguladors de la biosíntesi d'isoprenoides en plantes superiors. El principal objectiu de la meva tesi ha estat intentar superar les limitacions en la biosíntesi d'isoprenoides, analitzant els gens implicats en la seva producció i quines son les seves funcions, per tal de poder ser utilitzats en noves aplicacions d'enginyeria metabòlica. Els objectius generals van ser: a) millorar la producció de crocines en dues espècies de Nicotiana i comparar-ne l'acumulació; b) investigar la regulació del factor de transcripció OsBZ8 en gens de la via biosintètica d'isoprenoides en embrió i endosperma d'arròs; c) explorar el potencial del sistema CRISPR/Cas9 per generar una sèrie de mutants de blat de moro amb contingut alterat d'estrigolactona. Vaig enfocar els meus estudis en els enzims biosintètics de dues plantes productores de crocines, CsCCD2L (Crocus sativus) i BdCCD4.1 (Buddleja davidii) i vaig transferir els gens que les codifiquen a dues espècies diferents de Nicotiana. Vaig crear línies transgèniques que expressaven diferents combinacions dels gens i vaig investigar els perfils de crocines resultants per determinar com l'expressió del complement transgènic integrat influïa en l'acumulació de les crocines. Les plantes de N. glauca transgèniques que només expressaven CsCCD2L van acumular els nivells més alts de crocines. Els resultats obtinguts van indicar que N. glauca és una millor plataforma per a la producció de crocines que N. tabacum. També vaig demostrar que el factor de transcripció OsBZ8 i cinc gens associats, AACT3, HMGS1, HMGR1, DXS2, IPPI1, que estan involucrats a les vies MVA i MEP de l'arròs, exhibien patrons d'expressió similars a l'endosperm i a l'embrió de l'arròs. A més, vaig confirmar que OsBZ8 s'uneix específicament a una Gbox o una G/Cbox híbrida en els promotors de HMGR1, DXS2 i IPPI1. Vaig fer servir la tecnologia CRISPR/Cas9 per modular l'expressió dels gens ZmCCD7 i ZmCCD8, que estan involucrats en la biosíntesi d'estrigolactones al blat de moro. Induí mutacions per SpCas9 a la regió codificant de ZmCCD8, en dues línies independents de plantes. L'anàlisi dels mutants ZmCCD8 contribuirà a millorar els coneixements de la base molecular que controla les característiques fisiològiques estructurals del blat de moro. Caldrà seqüenciar el genoma de les següents generacions així com l'anàlisi metabolòmica per avaluar l'impacte d'aquestes mutacions. En conjunt, la meva tesi proporciona nous coneixements sobre la regulació de la biosíntesi d'isoprenoides en plantes superiors a diferents nivells, cosa que facilitarà la predicció de l'efecte de l'enginyeria metabòlica a les plantes per a la millora nutricional o la producció de metabòlits importants.

Mi tesis se centra en identificar y caracterizar mediante ingeniería genética, introduciendo genes o editando su genoma, los mecanismos reguladores de la biosíntesis de isoprenoides en plantas superiores. El principal objetivo de mi tesis ha sido intentar superar las limitaciones de la biosíntesis de isoprenoides analizando los genes implicados en su acumulación y cuáles son sus funciones, para poder ser utilizados en nuevas aplicaciones de ingeniería metabólica. Los objetivos generales fueron: a) mejorar la producción de crocinas en dos especies de Nicotiana y comparar su acumulación; b) investigar la regulación del factor de transcripción OsBZ8 en genes de la vía biosintética de isoprenoides en embrión y endospermo de arroz; c) explorar el potencial de CRISPR/Cas9 para generar una serie de mutantes de maíz con contenido alterado de estrigolactona. Enfoqué mis estudios en las enzimas biosintéticas de dos plantas productoras de crocinas, CsCCD2L (Crocus sativus) y BdCCD4.1 (Buddleja davidii) y transferí los genes que codifican para estas enzimas a dos especies diferentes de Nicotiana. Creé líneas transgénicas que expresaban diferentes combinaciones de genes e investigué los perfiles de crocinas resultantes para determinar cómo la expresión del complemento transgénico integrado influía en la acumulación de las crocinas. Las plantas de N. glauca transgénicas que solo expresaban CsCCD2L acumularon los niveles más altos de crocinas. Mis resultados indicaron que N. glauca es una mejor plataforma para la producción de crocinas que N. tabacum. También demostré que el factor de transcripción OsBZ8 y cinco genes asociados, AACT3, HMGS1, HMGR1, DXS2, IPPI1, que están involucrados en las vías MVA y MEP del arroz, exhibían patrones de expresión similares en el endospermo y en el embrión del arroz. Además, confirmé que OsBZ8 se une específicamente a una G-box o una G/C-box híbrida en los promotores de HMGR1, DXS2 e IPPI1. Usé la tecnología CRISPR/Cas9 para modular la expresión de los genes ZmCCD7 y ZmCCD8, que están involucrados en la biosíntesis de estrigolactonas (SL) en el maíz. Induje mutaciones por SpCas9 en la región codificante de ZmCCD8, en dos líneas independientes de plantas. El análisis de los mutantes ZmCCD8 contribuirá a una mejor comprensión de la base molecular que controla las características estructurales del maíz. Sera necesario secuenciar el genoma de las siguientes generaciones, así como el análisis metabolómico, para evaluar el impacto de estas mutaciones. En conjunto, mi tesis proporciona nuevos conocimientos sobre la regulación de la biosíntesis de isoprenoides en plantas superiores a diferentes niveles, lo que facilitará la predicción del efecto de la ingeniería metabólica en las plantas para la mejora nutricional o la producción de metabolitos importantes.

My thesis focuses on identifying and characterizing the regulatory mechanisms of isoprenoid biosynthesis in higher plants by multigene engineering and gene editing. The major aim of my thesis was to better understand the isoprenoid biosynthesis pathway's bottlenecks by analyzing genes involved in isoprenoid accumulation and their functionality for future use in metabolic engineering applications. The overall objectives were to: a) enhance the production of crocins in two Nicotiana species and compare the accumulation of crocins in these species; b) investigate the regulation of the transcription factor OsBZ8 on isoprenoid biosynthetic pathway genes in rice embryo and endosperm; c) explore the potential of CRISPR/Cas9 to generate a series of maize mutants with altered strigolactone contents. I focused on the biosynthetic enzymes of two crocin-producing plants, (Crocus sativus) CsCCD2L and (Buddleja davidii) BdCCD4.1 and transferred them to two different Nicotiana species. I created transgenic lines expressing different combinations of transgenes and investigated the resulting crocin profiles to determine how expression of the integrated transgene complement influenced the accumulation of crocin. Engineered N. glauca plants expressing CsCCD2L alone accumulated the highest levels of crocins. My results indicated that N. glauca is a better host for crocin production than N. tabacum. I demonstrated that the transcription factor OsBZ8 and five associated genes, AACT3, HMGS1, HMGR1, DXS2, IPPI1, which are involved in the rice MVA and MEP pathways, exhibited similar expression patterns in rice endosperm and embryo. Moreover, I confirmed that OsBZ8 specifically binds to a G-box or a hybrid G/C-box in the promoters of HMGR1, DXS2 and IPPI1. I used CRISPR/Cas9 technology to modulate the expression of ZmCCD7 and ZmCCD8, which are involved in Strigolactones (SL) biosynthesis in maize. I was able to recover SpCas9-induced mutations in two independent plant lines in the coding region of ZmCCD8. In depth analysis of the ZmCCD8 mutants I recovered will contribute towards a better understanding of the molecular basis controlling structural traits in maize. Future genome sequencing of subsequent generations as well as metabolomic analysis is needed to assess fully the impact of these mutations. Collectively my thesis provides novel insights of the regulation of isoprenoid biosynthesis in higher plants at different levels, which will make it easier to predict the effect of metabolic engineering in plants for nutritional improvement or the production of valuable metabolites.