Identification of novel candidate biomarkers of response to chemotherapeutic agents in patients with colorectal cancer

Abstract

El càncer colorectal és el tercer tipus de càncer més comú a tot el món. La majoria dels pacients amb càncer colorectal reben tractament quimioterapèutic durant el curs de la seva malaltia. Tot i això, l'eficàcia dels compostos quimioterapèutics com a agents únics no supera el 30%. Per millorar el maneig clínic dels pacients amb càncer colorectal, i a causa dels importants efectes secundaris i els alts costos mèdics, és fonamental identificar biomarcadors predictius de resposta al tractament en pacients amb càncer colorectal. Per identificar noves característiques moleculars dels tumors que podrien predir la resposta al tractament, primer vàrem determinar la sensibilitat com a agent únic a 5-fluorouracil (5-FU) i oxaliplatí en un panell de 57 línies cel·lulars de càncer colorectal, i a irinotecà en un panell estès de 90 línies cel·lulars. Després, adaptàrem la classificació estàndard RECIST (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) emprada per definir el grau de resposta dels pacients, per classificar la sensibilitat de les línies cel·lulars (cancer cell line Response Evaluation Criteria in Solid Tumors -cclRECIST). A més, vàrem obtenir dades d'alt rendiment d'expressió (seqüenciació d'ARN, microarrays i proteòmica de shogun) i mutació (seqüenciació de l'exoma) per a les línies cel·lulars de càncer colorectal per identificar possibles biomarcadors moleculars de resposta/resistència a aquests agents quimioterapèutics. Els resultats de l'estudi van demostrar que la taxa de resposta a l'irinotecà era significativament més baixa a les línies cel·lulars amb estabilitat de microsatèl·lits (MSS) en comparació amb les línies amb inestabilitat de microsatèl·lits (MSI), també més baixa als tumors KRAS mutants en comparació amb els tumors KRAS salvatge, i més baixa en el subtipus molecular de consens (CMS) 2 en comparació amb els tumors CMS1 i CMS4. A més, vàrem identificar 16 proteïnes amb una diferència significativa (FDR <0,2) de >2 vegades en la seva expressió entre línies cel·lulars resistents i sensibles a irinotecà. A continuació, es van seleccionar dues d'aquestes proteïnes, el transportador de solut SLC29A1 i la guanilat ciclasa GUCY2C, per a una validació en més profunditat utilitzant una cohort de 548 tumors de pacients amb càncer colorectal metastàtic que van rebre tractament basat en irinotecà. Abans d'avaluar els nivells relatius d'expressió de proteïnes mitjançant un enfocament immunohistoquímic en seccions histològiques de microarray de teixit (TMA), els anticossos utilitzats van ser validarts minuciosament. A continuació, l'expressió d'aquestes dues proteïnes es va determinar mitjançant immunohistoquímica a la cohort de 548 tumors colorectals primaris que va ser valorada per un patòleg. No es van trobar associacions entre l&#8217;expressió de SLC29A1 o GUCY2C i les taxes de resposta objectiva o la supervivència lliure de progressió en aquesta cohort de mostres. Tot i això, es va observar una associació significativa entre l'expressió de GUCY2C i la supervivència global dels pacients d'aquesta cohort. En conclusió, aquest estudi proporciona una caracterització exhaustiva de la sensibilitat a 5-fluorouracil, oxaliplatí i irinotecà en un panell de línies cel·lulars de càncer colorectal i ha permès identificar possibles biomarcadors predictius de resposta a aquests agents. Tot i que no es va poder confirmar el valor predictiu de dos d'aquests biomarcadors en una gran cohort de pacients amb càncer colorectal, en estudis futurs es validarà la capacitat d'altres biomarcadors candidats a l'entorn clínic. És important destacar que l'expressió de GUCY2C es va correlacionar significativament amb la supervivència dels pacients amb càncer colorectal i, per tant, es podria fer servir com un biomarcador de pronòstic capaç d'identificar un subgrup de pacients amb mal pronòstic i que són bons candidats per rebre un tractament més agressiu.

El cáncer colorrectal es el tercer tipo de cáncer más común en todo el mundo. La mayoría de los pacientes con cáncer colorrectal reciben tratamiento quimioterapéutico durante el curso de su enfermedad. Sin embargo, la eficacia de los compuestos quimioterapéuticos como agentes únicos no supera el 30%. Para mejorar el manejo clínico de los pacientes con cáncer colorrectal, y debido a los importantes efectos secundarios y los altos costes médicos, es fundamental identificar biomarcadores predictivos de respuesta al tratamiento en pacientes con cáncer colorrectal. Para identificar nuevas características moleculares de los tumores que podrían predecir la respuesta al tratamiento, primero determinamos la sensibilidad como agente único a 5-fluorouracilo (5-FU) y oxaliplatino en un panel de 57 líneas celulares de cáncer colorrectal y a irinotecán en un panel extendido de 90 líneas celulares. Luego, adaptamos la clasificación estándar RECIST (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) de la respuesta de los pacientes, para clasificar la sensibilidad de las líneas celulares (cancer cell line Response Evaluation Criteria in Solid Tumors -cclRECIST). Además, se obtuvieron datos de alto rendimiento de expresión (secuenciación de ARN, microarrays y proteómica de shogun) y mutación (secuenciación del exoma) para las líneas celulares de cáncer colorrectal con el objetivo de identificar posibles biomarcadores moleculares de respuesta/resistencia a estos agentes quimioterapéuticos. Los resultado del estudio demostraron que la tasa de respuesta al irinotecán era significativamente más baja en las líneas celulares con microsatélites estables (MSS) en comparación con las líneas con microsatélites inestables (MSI), más baja en los tumores KRAS mutantes en comparación con los tumores KRAS de tipo salvaje, y más baja en el subtipo molecular de consenso (CMS) 2 en comparación con los tumores CMS1 y CMS4. Además, identificamos 16 proteínas con una diferencia significativa (FDR <0,2) de >2 veces en su expresión entre líneas celulares que son resistentes y sensibles a irinotecán. A continuación, se seleccionaron dos de estas proteínas, el transportador de soluto SLC29A1 y la guanilato ciclasa GUCY2C, para una validación en mayor profundidad utilizando una cohorte de 548 tumores de pacientes con cáncer colorrectal metastásico que recibieron tratamiento basado en irinotecán. Antes de evaluar los niveles relativos de expresión de proteínas mediante un enfoque inmunohistoquímico en secciones de una mocroarray de tejido (TMA), los anticuerpos utilizados se validaron minuciosamente. A continuación, la expresión de estas dos proteínas se determinó mediante inmunohistoquímica en la cohorte de 548 tumores colorrectales primarios que fue valorada por un patólogo. No se encontraron asociaciones entre la expresión de SLC29A1 o GUCY2C y las tasas de respuesta objetiva o la supervivencia libre de progresión en esta cohorte de muestras. Sin embargo, se observó una asociación significativa entre la expresión de GUCY2C y la supervivencia global de los pacientes de esta cohorte. En conclusión, este estudio proporciona una caracterización exhaustiva de la sensibilidad a 5-fluorouracilo, oxaliplatino e irinotecán en un panel de líneas celulares de cáncer colorrectal y se identificaron posibles biomarcadores predictivos de respuesta a estos agentes. Aunque no se pudo confirmar el valor predictivo de dos de estos biomarcadores en una gran cohorte de pacientes con cáncer colorrectal, en estudios futuros se validará la capacidad de otros biomarcadores candidatos en el entorno clínico. Es importante destacar que la expresión de GUCY2C se correlacionó significativamente con la supervivencia de los pacientes con cáncer colorrectal y, por lo tanto, podría usarse como un biomarcador de pronóstico capaz de identificar un subgrupo de pacientes con mal pronóstico y que son buenos candidatos para recibir un tratamiento más agresivo.

Colorectal cancer (CRC) is the third most common type of cancer worldwide. Most CRC patients receive chemotherapeutic treatment during the course of their disease. However, the efficacy of chemotherapeutic compounds as single agents is not greater than 30%. To improve the clinical management of CRC patients, and due to significant side effects and high medical costs, it is essential to identify predictive biomarkers of response to treatment in patients with CRC. To identify novel molecular features of the tumors that could predict response to treatment, first, we determined the in vitro sensitivity as a single agent to 5-Fluorouracil (5-FU) and oxaliplatin in a panel of 57 colorectal cancer cell lines and to irinotecan in an extended panel of 90 cell lines. Then, we adapted the standard RECIST (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) classification of patients&#8217; response to treatment to classify the cell line&#8217;s sensitivity (cancer cell line Response Evaluation Criteria in Solid Tumors &#8211;cclRECIST). In addition, high-throughput expression (RNA-sequencing, microarray and shogun proteomics) and mutation (exome-sequencing) data were obtained for the CRC cell lines to identify candidate molecular biomarkers of response/resistance to these chemotherapeutic agents. The response rate to the irinotecan was found to be significantly lower in cell lines with microsatellite stable (MSS) compared to microsatellite instable (MSI) tumors, lower in KRAS mutant compared to KRAS wild type tumors, and lower in Consensus Molecular subtype (CMS) 2 compared to CMS1 and CMS4 tumors. Moreover, we identified 16 proteins with >2-fold significant (FDR <0.2) difference in their expression between cell lines that are resistant and sensitive to irinotecan. Two of these proteins, the solute carrier SLC29A1 and the guanylate cyclase GUCY2C, were then selected for further validation using a large cohort of 548 tumors from metastatic colorectal cancer patients that received irinotecan-based treatment. Before assessing the relative levels of protein expression using an immunohistochemical approach on sections of a tissue microarray, the antibodies used were thoroughly validated. The expression of these two proteins was then determined by immunohistochemistry in the cohort of 548 primary colorectal tumors and scored by a trained pathologist. The expression of SLC29A1 or GUCY2C was not associated with the objective response rates or the progression-free survival in this cohort of samples. However, a significant association was observed between the expression of GUCY2C and the overall survival of the patients in this cohort. In conclusion, this study provides a thorough characterization of the sensitivity to 5-fluorouracil, oxaliplatin and irinotecan in a large panel of CRC cell lines and potential predictive biomarkers of response to these agents were identified. Although the predictive value of two of these biomarkers could not be confirmed in a large cohort of colorectal cancer patients, future studies are needed to validate the capacity of other candidate biomarkers in the clinical setting. Importantly, the expression of GUCY2C was significantly correlated with the overall survival of colorectal cancer patients, and could therefore be used as a prognostic biomarker capable of identifying a subset of patients with poor prognosis and that are good candidates to receive a more aggressive treatment.