Circulating cell-derived extracellular vesicles and epigenetic small non-coding ribonucleic acids in chronic heart failure

Abstract

Introducció: La insuficiència cardíaca (IC) és una entitat complexa d’alt impacte clínic i fisiopatologia poc coneguda. És una patologia difícil de reconèixer i de diagnosticar, caracteritzada per una alteració cardíaca d’etiologia variable. Les vesícules extracel·lulars (EVs per les seves sigles en anglès) són vesícules (0.1–1µm) alliberades en resposta a l’estrès o l’activació cel·lular que tenen antígens derivats de les seves cèl·lules parentals. Són les transportadores principals d’ARN al plasma, incloent els microARNs (miRNAs per les seves sigles en anglès) que estan implicats en la regulació epigenètica. En aquesta tesi hipotetitzem que ambdós, les EVs i els miRNAs, estan desregulats i potencialment relacionats amb la fisiopatologia de la IC crònica (ICC). Objectius: Identificar i caracteritzar les signatures circulants diferencials de les EVs i els miRNAs, i relacionar-les amb funcions moleculars i processos biològics implicats en el desenvolupament i la progressió de la ICC. Mètodes: Les EVs i els miRNAs circulants es van aïllar del plasma dels individus amb i sense ICC (aparellats per sexe i edat) inclosos en aquest estudi. Les EVs circulants es van analitzar mitjançant citometria de flux, usant anticossos monoclonals específics i annexina V (marcador de fosfatidilserina). Els seus nivells es van relacionar amb la presència i gravetat de la ICC, i la seva etiologia. Els miRNAs es van identificar i quantificar mitjançant qRT-PCR i els seus nivells es van associar amb la gravetat, pronòstic, etiologia, i la classificació de la ICC segons la fracció d’ejecció del ventricle esquerre (FEVE). L’anàlisi in silico, usant xarxes d’interacció proteica i enriquiment de vies, es va utilitzar per identificar mecanismes relacionats amb el desenvolupament de la ICC. El poder discriminador de les EVs, els miRNAs i les seves combinacions amb altres biomarcadors, es va investigar mitjançant corbes ROC (per les seves sigles en anglès). Resultats: Els pacients amb ICC, en comparació amb subjectes sense ICC, tenien nivells incrementats de EVs circulants derivades de cèl·lules immunes. Les EVs provenien de cèl·lules d’immunitat innata i adaptativa (monòcits i neutròfils, limfòcits-T i cèl·lules natural killer, respectivament). Les EVs derivades de limfòcits-T i neutròfils activats, i de limfòcits-T no activats, correlacionaven amb la gravetat de la ICC (classificació NYHA). A més, els pacients amb ICC isquèmica presentaven els nivells més alts de EVs derivades de limfòcits-T i neutròfils. L’anàlisi ROC va mostrar que la combinació d’EVs de leucòcits/neutròfils discriminava millor que el biomarcador NT-proBNP la gravetat de la malaltia en aquests pacients. També es va identificar i validar un patró plasmàtic diferencial de 8 miRNAs (let-7a-5p, miR-30b-5p, miR-107, miR-125a-5p, miR-139-5p, miR-150-5p, miR-335-5p i miR-342-3p) amb expressió reduïda en pacients amb ICC, comparats amb individus sense ICC. Usant anàlisis in silico i aproximacions de biologia de sistemes, vam evidenciar que els gens diana de 7 d’aquests miRNAs, organitzats en grups, participaven en mecanismes moleculars i vies de senyalització relacionades amb la ICC, incloent el cicle i la senescència cel·lular, i les vies de senyalització de Ras, citocines, PI3K-AKT i TGF-β. Addicionalment, aquests grups discriminaven pacients segons la seva FEVE (preservada i reduïda) i la seva etiologia de base. Conclusió: Els resultats d’aquesta tesi mostren un patró diferencial d’EVs i miRNAs en el plasma de pacients amb ICC, així com també una activació significativa de cèl·lules immunes, reflectida en l’alt alliberament d’EVs positives per antígens específics. Les cèl·lules immunes (innates i adaptatives), mediant l’alliberament d’EVs i la seva càrrega (incloent miRNAs) podrien promoure la progressió de la malaltia, així com també l’afectació d’òrgans allunyats del cor (ronyons, etc.). De forma concordant, els patrons alterats de miRNAs circulants en ICC podrien contribuir, mitjançant la regulació paracrina, al deteriorament clínic d’aquests pacients.

Introducción: La insuficiencia cardíaca (IC) es una entidad compleja, de alto impacto clínico y fisiopatología poco conocida. Es una patología difícil de identificar y diagnosticar, caracterizada por una alteración cardíaca de etiología variable. Las vesículas extracelulares (EVs por sus siglas en inglés) son vesículas (0.1–1µm) liberadas en respuesta al estrés o activación celular que tienen antígenos derivados de sus células parentales. Son las transportadoras principales de ARN en plasma, incluyendo los microARNs (miRNAs por sus siglas en inglés), que están implicados en la regulación epigenética. En esta tesis hipotetizamos que ambos, las EVs y los miRNAs, están desregulados y potencialmente relacionados con la fisiopatología de la IC crónica (ICC). Objetivos: Identificar y caracterizar las signaturas circulantes diferenciales de las EVs y los miRNAs, y relacionarlas con funciones moleculares y procesos biológicos implicados en el desarrollo y la progresión de la ICC. Métodos: Las EVs y los miRNAs circulantes se aislaron del plasma de los individuos con y sin ICC (apareados por sexo y edad) incluidos en este estudio. Las EVs circulantes se analizaron mediante citometría de flujo, usando anticuerpos monoclonales específicos y anexina V (marcador de fosfatidilserina). Sus niveles se relacionaron con la presencia y gravedad de la ICC y su etiología. Los miRNAs se identificaron y cuantificaron mediante qRT-PCR y sus niveles se asociaron con la gravedad, pronóstico, etiología, y la clasificación de la ICC según la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI). El análisis in silico, mediante el uso de redes de interacción proteica y enriquecimiento de vías, se usó para identificar mecanismos relacionados con el desarrollo de la ICC. El poder discriminativo de las EVs, los miRNAs y sus combinaciones con otros biomarcadores, se investigó mediante curvas ROC (por sus siglas en inglés). Resultados: Los pacientes con ICC, comparados con sujetos sin ICC, tenían niveles incrementados de EVs circulantes derivadas de células inmunes. Las EVs provenían de células de inmunidad innata y adaptativa (monocitos y neutrófilos, y linfocitos-T y células natural killer, respectivamente). Las EVs derivadas de linfocitos-T y neutrófilos activados, y de linfocitos-T no activados, correlacionaban con la gravedad de la ICC (clasificación NYHA). Además, los pacientes con ICC isquémica presentaban los niveles más altos de EVs de linfocitos-T y neutrófilos. El análisis ROC reveló que la combinación de EVs de leucocitos/neutrófilos discriminaba mejor que el biomarcador NT-proBNP la gravedad de la enfermedad en estos pacientes. También se identificó y validó un patrón plasmático diferencial de 8 miRNAs (let-7a-5p, miR-30b-5p, miR-107, miR-125a-5p, miR-139-5p, miR-150-5p, miR-335-5p y miR-342-3p), con expresión disminuida en pacientes con ICC en oposición a sujetos sin ICC. Usando un análisis in silico y aproximaciones de biología de sistemas, evidenciamos que los genes diana de 7 de dichos miRNAs organizados en grupos, participaban en mecanismos moleculares y vías de señalización relacionadas con la ICC, incluyendo el ciclo y la senescencia celular, y las vías de señalización de Ras, citoquinas, PI3K-AKT y TGF-β. Adicionalmente, estos grupos podían discriminar pacientes según su FEVI (preservada y reducida) y su etiología de base. Conclusión: Los resultados de esta tesis muestran un patrón diferencial de EVs y miRNAs en el plasma de pacientes con ICC. Los resultados muestran una activación significativa de células inmunes, reflejada por la alta liberación de EVs positivas por antígenos específicos. Las células inmunes (innatas y adaptativas), mediante la liberación de EVs y su carga (incluyendo miRNAs) podrían promover la progresión de la enfermedad, así como la afectación de órganos alejados del corazón (riñones, etc.). De forma concordante, los patrones alterados de miRNAs circulantes en ICC podrían contribuir, mediante regulación paracrina, al deterioro clínico de estos pacientes.

Introduction: Heart failure (HF) is a complex entity with a high clinical impact and poorly understood pathophysiology. Characterised by cardiac function impairment and variable underlying aetiology, HF is difficult to be recognised and diagnosed. Circulating extracellular vesicles (EVs) are small vesicles (0.1–1µm) shed after cellular stress or activation that present parental-cell antigens on their surface. EVs are the main carriers of RNA in plasma, including coding and non-coding RNAs such as microRNAs (miRNAs), which are involved in epigenetic regulation. In this thesis, we hypothesise that both EVs and miRNAs are deregulated in chronic HF (CHF) and are potentially involved in its pathophysiology. Objectives: This thesis aimed to identify and characterise differential signatures of circulating EVs and miRNAs in plasma, in association with molecular functions and biological processes related to CHF development and progression. Methods: CHF patients and individuals without CHF (matched by sex and age) were included in the study. Circulating EVs and miRNAs were isolated from plasma samples. Circulating EVs were analysed by flow cytometry using specific monoclonal antibodies and annexin V (phosphatidylserine marker) and their levels related to the presence and severity of CHF and its underlying aetiology. MicroRNAs were analysed using a non-targeted approach (qRT-PCR) for their identification and quantification in CHF and non-CHF patients. miRNA levels in plasma were associated with CHF severity, underlying aetiology, left ventricular ejection fraction (LVEF) classification and prognosis. In silico analysis of miRNAs’ target genes was pursued to identify pathways related to disease development using protein-protein interaction networks and pathway enrichment analysis. The value of circulating EVs and miRNAs to discriminate patients according to disease severity and underlying aetiology was investigated by receiver operating curve (ROC). Combined probabilities of circulating EVs or miRNAs with other used biomarkers were also investigated. Results: CHF patients had increased levels of circulating EVs shed by immune cells in comparison to non-CHF. Immune-cell-derived EVs in CHF patients’ plasma were mostly derived from innate and adaptative immune cells (monocytes and neutrophils, T-lymphocytes and natural killer cells, respectively), and carried activation leukocyte markers. Interestingly, EVs from activated T-lymphocytes and neutrophils, as well as EVs from non-activated T-lymphocytes, correlated with disease severity (NYHA classification). Additionally, CHF patients with ischaemic aetiology had the highest levels of EVs shed by T-lymphocytes and neutrophils. ROC curve analysis revealed that the combination of EVs derived from leukocytes/neutrophils discriminated disease severity better than the used biomarker NT-proBNP in these patients. Regarding the circulating miRNAs, we identified and validated a differential pattern of 8 miRNAs (let-7a-5p, miR-30b-5p, miR-107, miR-125a-5p, miR-139-5p, miR-150-5p, miR-335-5p and miR-342-3p) downregulated in the systemic circulation of CHF patients. Furthermore, by using in silico analysis and systems biology approaches to identify their target genes and predict protein-protein interactions, we evidenced that target genes from 7 of these miRNAs, when organised in clusters, participated in molecular mechanisms and signalling pathways related to CHF, including cell cycle, cellular senescence and Ras, chemokine, PI3K-AKT and TGF-β signalling. Moreover, they could discriminate CHF patients according to their LVEF (preserved and reduced) and to their background aetiology. Conclusion: The results of this thesis show a differential pattern of EVs and miRNAs in the plasma of CHF patients. The results suggest a significant activation of the immune cells as shown by the high release of EVs positive for specific epitopes. Activated innate and adaptive immune cells, through the release of EVs and their carried messengers including miRNAs might promote disease progression and affectation of distant organs related to the heart (e.g., kidney). In agreement, altered patterns of circulating miRNAs in CHF might contribute through paracrine regulation to the clinical deterioration of these patients.