Simple biochemistry for complex protein-based materials

Abstract

Les cèl·lules són entitats capaces de construir increïbles estructures supramoleculars jerarquitzades amb funcions ubiqües i imprescindibles, sent els complexos basats en proteïnes els principals efectors d’un ampli ventall de reaccions biològiques. Els científics van començar a replicar aquests processos naturals amb l’objectiu de comprendre millor com utilitzar les proteïnes en forma d’eines biotecnològiques per a solucionar les creixents necessitats mèdiques actuals. Proteïnes de diferents orígens es van començar a produir i purificar com a entitats recombinants, principalment fusionades a cues d’histidines, convertint-se en el punt focal d’una nova revolució tecnològica. La constant optimització de les metodologies d’enginyeria de proteïnes va permetre dissenyar racionalment proteïnes multidomini capaces d’adaptar-se i respondre eficaçment a un entorn canviant. Els productes resultants es van implantar amb èxit com a fàrmacs humans (p. ex., Aflibercept, Denileukin...), encara que amb les seves pròpies limitacions, com ara una ineficient biodistribució i baixa vida mitjana en el torrent sanguini. La nanobiotecnología va sorgir com una alternativa viable per a garantir l’adequada interacció d’aquestes proteïnes modulars (i altres biomolècules) amb el món subcelular, i assegurar així una correcta biodistribució i la conseqüent eficàcia del tractament (p. ex., Abraxane). Per aquest motiu, s’ha desenvolupat un nou conjunt de biomaterials amb la idea de garantir l’adequat direccionament i eficàcia del tractament, minimitzant al mateix temps els possibles efectes adversos. Dos de les estratègies més representatives inclouen, (a) un principi d’autoensamblatge de nanopartícules proteiques mitjançant l’ús d’un pèptid catiònic i una cua d’histidines, i (b) un principi d’autoensamblatge a mode de cossos d’inclusió (és a dir, micropartícules que alliberen proteïna de forma sostinguda). Totes dues estratègies han anat mostrant resultats biomèdics prometedors, encara que al mateix temps considerables limitacions, com (1) baixa reproductibilitat entre lots (és a dir, control de la grandària final), (2) baix control del procés d’ensamblatge (és a dir, control de l’estat oligomèric), (3) versatilitat restringida durant la formulació, (4) problemes de biocompatibilitat, (5) complexitat en la fabricació, i (6) problemes d’homogeneïtat del producte. Aquesta tesi s’ha centrat en explorar un principi bioquímic nou i simple per a formular materials proteics versàtils, no tòxics i eficients, amb la idea de solucionar les limitacions esmentades fins ara. La coordinació de cations divalents amb les cues d’histidines ha aparegut com un mètode racional, eficaç i fàcil per a fabricar materials proteics que permeten crear estructures tant nano com micro -particulades de major complexitat. Els productes resultants es mantenen homogenis, estables (enfront a temperatura i enfront a diferents agents químics) i la seva fabricació és reproduïble entre lots. El procediment implementat és versàtil i robust, sent així una gran millora respecte als procediments anteriors. El procés de manufactura es basa en un ensamblatge controlat que permet un direccionament i biodistribució eficients de l’agent terapèutic (de forma dirigida i evitant el filtrat renal), i una formulació senzilla; a més de considerar en tot moment els possibles problemes de biocompatibilitat. D’altra banda, aquesta nova plataforma ha estat validada en diferents camps biomèdics (com ara el direccionament dirigit de fàrmacs, enginyeria de teixits, biocatàlisis i el tractament de malalties infeccioses). En resum, i tenint en compte les limitacions encara presents i per resoldre, hem aconseguit desenvolupar un principi bioquímic simple, basat en la coordinació de cations divalents amb cues d’histidines, que promou l’ensamblatge controlat de proteïnes (tant nano com micro -estructurades) on la versatilitat funcional, la robustesa i la transversalitat del sistema han estat reiteradament demostrades.

Las células son entidades capaces de construir increíbles estructuras supramoleculares jerarquizadas con funciones ubicuas e imprescindibles, siendo los complejos basados en proteínas los principales efectores de un amplio abanico de reacciones biológicas. Los científicos comenzaron a replicar estos procesos naturales con el objetivo de comprender mejor cómo utilizar las proteínas a modo de herramientas biotecnológicas para solventar las crecientes necesidades médicas actuales. Proteínas de distintos orígenes se empezaron a producir y purificar como entidades recombinantes, principalmente fusionadas a colas de histidinas, convirtiéndose en el punto focal de una nueva revolución tecnológica. La constante optimización de las metodologías de ingeniería de proteínas permitió diseñar racionalmente proteínas multidominio capaces de adaptarse y responder eficazmente a un entorno cambiante. Los productos resultantes se implantaron con éxito como fármacos humanos (p. ej., Aflibercept, Denileukin...), aunque con sus propias limitaciones tales como una ineficiente biodistribución y baja vida media en el torrente sanguíneo. La nanobiotecnología surgió como una alternativa viable para garantizar la adecuada interacción de estas proteínas modulares (y otras biomoléculas) con el mundo subcelular, y asegurar así una correcta biodistribución y la consecuente eficacia del tratamiento (p. ej., Abraxane). Por este motivo, se ha desarrollado un nuevo conjunto de biomateriales con la idea de garantizar la adecuada entrega y eficacia del tratamiento, minimizando al mismo tiempo los posibles efectos adversos. Dos de las estrategias más representativas incluyen, (a) un principio de autoensamblado de nanopartículas proteicas mediante el uso de un péptido catiónico y una cola de histidinas, y (b) un principio de autoensamblado a modo de cuerpos de inclusión (es decir, micropartículas que liberan proteína de forma sostenida). Ambas estrategias han ido mostrando resultados biomédicos prometedores, aunque al mismo tiempo considerables limitaciones, como (1) baja reproducibilidad entre lotes (es decir, control del tamaño final), (2) bajo control del ensamblado (es decir, control del estado oligomérico), (3) versatilidad restringida durante la formulación, (4) problemas de biocompatibilidad, (5) complejidad en la fabricación, y (6) problemas de homogeneidad del producto. Esta tesis se ha centrado en explorar un principio bioquímico novedoso y simple para formular materiales proteicos versátiles, no tóxicos y eficientes, con la idea de solucionar las limitaciones mencionadas hasta ahora. La coordinación de cationes divalentes con las colas de histidinas ha aparecido como un método racional, eficaz y fácil para fabricar materiales proteicos que permiten crear estructuras tanto nano como micro -particuladas de mayor complejidad. Los productos resultantes permaneces homogéneos, estables (frente a temperatura y frente a diferentes agentes químicos) y su fabricación es reproducible entre lotes. El procedimiento implementado es versátil y robusto, siendo así una gran mejora con respecto a los procedimientos anteriores. El proceso de manufactura se basa en un ensamblaje controlado que permite una entrega y biodistribución eficientes del agente terapéutico (de forma dirigida y evitando el filtrado renal), y una formulación sencilla; además de considerar en todo momento los posibles problemas de biocompatibilidad. Por otro lado, esta nueva plataforma ha sido validada en diferentes campos biomédicos (tales como la entrega dirigida de fármacos, ingeniería de tejidos, biocatálisis y el tratamiento de enfermedades infecciosas). En resumen, y teniendo en cuenta las limitaciones aún presentes y por resolver, hemos logrado desarrollar un principio bioquímico simple, basado en la coordinación de cationes divalentes con colas de histidinas, que promueve el ensamblaje controlado de proteínas (tanto nano como micro -estructuradas) donde la versatilidad funcional, la robustez y la transversalidad del sistema han sido reiteradamente demostradas.

Cells have emerged as incredible builders of hierarchic supramolecular structures with ubiquitous and indispensable cell functions, being protein-based complexes the major effectors of a vast landscape of biological reactions. Scientists started to replicate these natural processes, aiming at a better understanding of proteins as biotechnological tools to resolve the current and increasing medical needs. Outsourced proteins from different origins, began to be produced and purified as recombinant entities, majorly histidine tagged, and thus becoming the focal point of a new technological revolution. The continued optimization of the protein engineering methodologies allowed to rationally design all-in-one multidomain proteins capable of dynamically adapt and efficiently respond to a fluctuant environment. The resultant products were successfully installed as human therapeutic drugs (e.g., Aflibercept, Denileukin…) with their own limitations, translated as inefficient biodistribution and low lifetime in the bloodstream. Nanobiotechnology raised as a viable complement to ensure the proper interaction of modular proteins (and other biomolecules) with the subcellular world, and guaranteeing the adequate biodistribution, and efficacy of the treatment (e.g., Abraxane). That is why, a new set of biomaterials have been explicitly developed to secure the product’s efficient delivery and therapeutic abilities while minimizing the plausible deleterious effects. Two of the most representative strategies include, (a) a self-assembling principle of protein-based nanoparticles based on a cationic-histidine tag pair, and (b) the naturally occurring inclusion bodies (meaning sustained protein-releasing microparticles). Both strategies displayed promising biomedical results, but still manifested its own clinical concerns, like (1) low reproducibility between batches (meaning size control), (2) low assembling control (meaning procedure control), (3) restricted formulation versatility, (4) biocompatibility issues, (5) limited formulation in a cost-effective manner (meaning manufacturing simplicity) and (6) product homogeneity issues. Hence, this thesis has been weaved to explore a novel and simple biochemical principle to formulate versatile, non-toxic, and efficient protein-based materials to tackle the already mentioned clinical concerns. The cross-linking between divalent cations and the histidine tag has been fully demonstrated as a powerful and easy rational approach to manufacture higher-in-complexity both nano- and micro-scale protein-based materials. The resultant products remain homogeneous in composition, stable upon thermal and chemical treatment and reproducible between batches. The implemented procedure beholds high therapeutic and formulation versatility, as well as a great improvement in regard to the previous outdated assembling strategies. The design and manufacturing processes fall upon a controllable assembly, efficient delivery (targeting possibilities) and biodistribution (avoidance of renal filtration), and cost-effective formulation (simplicity) while considering biocompatibility issues. Also, the platform capacity to be successfully implemented in different biomedical fields (such as drug delivery, tissue engineering, biocatalysis and the treatment of infectious diseases) has been validated. All in all, and still considering the ongoing issues to be resolved, we have been able to develop a simple biochemical principle, based on divalent cation gluing with histidine tags, to promote the controlled self-structuring of proteins into nano- and micro-scale entities in which system’s functional versatility, robustness and transversality has been repetitively and fully evidenced.