Studies of viral and host biomarkers in hepatitis C virus infected patients

Abstract

L’hepatitis C crònica és una de les principals causes de malaltia hepàtica en fase terminal i principal indicació de transplantament hepàtic (TH). El tractament amb antivirals d’acció directa (DAAs) permet l’eliminació viral en el 98% dels casos, però no evita l’evolució de la malaltia, principalment en pacients amb fases avançades. En aquest sentit, tant els factors virals com els de l’hoste juguen un paper clau en l’evolució de la malaltia i per això, aquesta tesi pretén abordar alguns d’aquests aspectes. L’objectiu del primer estudi va ser analitzar el paper de factors virals, tals com la càrrega viral i la complexitat de les quasiespècies com a índexs predictius de progressió de dany hepàtic després del TH en pacients no tractats, per determinar quin seria el moment òptim per administrar els DAAs post-TH. Els resultats van demostrar que la composició de les quasiespècies difereix entre pacients i que els índexs de diversitat viral no mostren capacitat predictiva de progressió de fibrosis. Ara bé, l’augment de càrrega viral als 15 dies del TH respecte a la carga viral abans del TH, si que és un factor predictiu de progressió de dany hepàtic a l’any del TH. L’objectiu del segon estudi es centra en factors de l’hoste, en estudiar l’eficàcia de la resposta immune adaptativa com a factor clau en l’evolució de la malaltia. L’exposició constant a antígens virals junt amb altres factors immunològics durant la infecció crònica, dóna lloc a un deteriorament funcional de les cèl·lules T. La discussió actual, es centra en què ocorre a la resposta immune adaptativa un cop s’elimina el virus, si es produeix una restauració total, parcial o no es recupera. Per això en el segon estudi es van analitzar els canvis fenotípics i funcionals de les cèl·lules T CD4+ i CD8+ abans, durant i després del tractament. Abans dels DAAs, es va observar que les cèl·lules CD4+ presentaven un fenotip d’esgotament caracteritzat per una forta expressió de PD-1. L’anàlisi de la resposta de les cèl·lules T després d’eliminar el virus, va mostrar una reducció de l’expressió de PD-1 de les cèl·lules T CD4+ en pacients no cirròtics, sense tractament previ i menors de 55 anys no tractats prèviament, així com una restauració de la capacitat de proliferació de les cèl·lules T específiques del VHC en la majoria dels pacients. Contràriament, els perfils de citocines del tipus T-helper 1 (IFN-γ i IL-2), continuaven deteriorats després de 12 setmanes de l’eliminació del VHC. Així doncs els resultats mostren una restauració parcial de la resposta immune adaptativa. En quant al dany hepàtic, l’eliminació del virus en tots els casos va suposar una reducció de la inflamació hepàtica i una regressió de la fibrosis, indicant-ne l’efecte positiu dels DAAs que porta a la regeneració hepàtica generalitzada, malgrat l’evolució d’alguns pacients cap a l’hepatocarcinoma. Amb aquesta premissa cal buscar noves eines que permetin la detecció precoç de malalties hepàtiques avançades. En aquest sentit, els miRNAs encapsulats en vesícules extracel·lulars (EVs) són potencials biomarcadors de diagnòstic i pronòstic, ja que proporcionen informació rellevant de l’estat del pacient, mitjançant mètodes no invasius. No obstant, la manca d’un mètode estandarditzat per descobrir nous biomarcadors dificulta l’aplicació d’aquestes eines. Per la qual cosa, l’objectiu del tercer estudi ha estat comparar diferents mètodes d’aïllament d’EVs i d’anàlisis de miRNAs per l’aplicació clínica. Els resultats han mostrat que els gradients de iodixanol per separar EVs i la preparació de llibreries amb el kit NEBNext Multiplex Small RNA Library per seqüenciació massiva, són els mètodes més reproduïbles i precisos per detectar miRNAs i utilitzar-los com a biomarcadors per la detecció precoç de malalties derivades de la infecció per VHC.

La hepatitis C crónica es una de las principales causas de enfermedad hepática en fase terminal e indicación de trasplante hepático (TH). El tratamiento con antivirales de acción directa (DAAs) permite la eliminación viral en el 98% de los casos pero no evita la evolución de la enfermedad, principalmente en paciente con fases avanzadas. Tanto los factores virales como del huésped juegan un papel clave en la evolución de la enfermedad y por eso, esta tesis pretende abordar algunos de estos aspectos. El objetivo del primer estudio consiste en analizar el papel de factores virales, tales como la carga viral y la complejidad de las quasispecies como índices predictivos de progresión de daño hepático después del TH en pacientes no tratados, y cuál sería el momento óptimo para administrar los DAAs post-TH. Los resultados demostraron que la composición de las quasispecies difiere entre pacientes y que los índices de diversidad viral no muestran capacidad predictiva de progresión de fibrosis. Sin embargo, el aumento de la carga viral a los 15 días del TH respecto a la carga viral antes del TH, sí que es un factor predictivo de progresión de daño hepático al año del TH. El objetivo del segundo estudio se centra en factores del huésped, en estudiar la eficacia de la respuesta inmune adaptativa como factor clave en la evolución de la enfermedad. La exposición constante a antígenos virales junto con otros factores inmunológicos durante la infección crónica, da lugar a un deterioro funcional de las células T. La discusión actual se centra en que ocurre a la respuesta inmunitaria adaptativa una vez eliminado el virus, si se produce una restauración total, parcial o no se recupera. Por eso, en el segundo estudio se analizaron los cambios fenotípicos y funcionales de las células T CD4+ y CD8+ antes, durante y después del tratamiento. Antes de los DAAs, se observó que las células CD4+ presentaban un fenotipo de agotamiento caracterizado por una fuerte expresión de PD-1. El análisis de las células T tras eliminar el virus mostró una reducción de la expresión de PD-1 en las T CD4+ en pacientes no cirróticos, no tratados previamente y no tratados previamente menores de 55 años, así como una restauración de la capacidad de proliferación de las células T específicas del VHC en la mayoría de pacientes. Contrariamente, los perfiles de citoquinas del tipo T-helper1 (IFN-γ y IL-2), seguían deteriorados tras 12 semanas de eliminar el virus. Así pues, los resultados muestran una restauración parcial de la respuesta inmune adaptativa. En cuanto al daño hepático, la eliminación del virus en todos los casos supuso una reducción de la inflamación hepática y una regresión de la fibrosis, indicando el efecto positivo de los DAAs que llevan a una regeneración hepática generalizada, a pesar de la evolución de algunos pacientes hacia hepatocarcinoma. Por eso es necesario buscar nuevas herramientas que permitan la detección precoz de enfermedades hepáticas avanzadas. Los miRNAs encapsulados en vesículas extracelulares (EVs) son potenciales biomarcadores de diagnóstico y pronóstico, ya que proporcionan información relevante del estado de los pacientes mediante métodos no invasivos. No obstante, la manca de un método estandarizado para descubrir nuevos biomarcadores dificulta su aplicación. Con lo cual, el objetivo del tercer estudio fue comparar diferentes métodos de aislamiento de EVs y análisis de miRNAs para la aplicación clínica. Los resultados mostraron que los gradientes de iodixanol para aislar EVs y la preparación de librerías con el kit NEBNext Multiplex Small RNA Library para secuenciación masiva, son los métodos más reproducibles y precisos para detectar miRNAs-biomarcadores para la detección precoz de enfermedades derivadas de la infección por VHC.

Chronic hepatitis C infection is one of the major causes of end-stage liver disease and an indication for liver transplantation (LT). Treatment with direct acting antivirals (DAAs) achieve viral elimination in 98% of cases, but does not prevent disease’s evolution, mainly in patients with advanced stages. In this sense, both viral and host factors play a key role in disease’s evolution, therefore this thesis aims to address some of these aspects. The objective of the first study was to analyse the role of viral factors, such as viral load and quasispecies complexity, as predictive indices of liver damage progression after LT in untreated patients, to determine which would be the optimal timing to administer DAAs after LT. Results demonstrated that HCV kinetics differ between patients, and that none of the diversity measures have shown predictive capacity of fibrosis progression. However, the increase in viral load at 15th day post-LT compared to the viral load pre-LT, is indeed a predictive factor of liver damage progression after one year of the LT. The objective of the second study focuses on host factors, on study the effectiveness of adaptive immune response as a key factor in the evolution of the disease. During chronic HCV infection, constant exposure to viral antigens along with immunological factors results in functional impairment of T-cell functions. The current discussion focuses on what happens to the adaptive immune response once the virus is eliminated, whether there is a full, partial restoration or no recovery. Therefore, in the second study, the phenotypic and functional changes of CD4+ and CD8+ T cells were analysed before, during and after treatment. Before DAAs, CD4+T cells were observed to exhibit an exhaustion phenotype characterized by a strong PD-1 expression. Analysis of T-cell response after eliminating the virus showed a reduction in PD-1 expression of CD4+ T cells in non-cirrhotic, naïve and patients-naïve younger than 55 years, as well as a restoration of the proliferative capacity of HCV-specific T cells in most patients. Conversely, T-helper 1-type cytokine profiles (IFN- γ and IL-2) remained impaired upon 12 weeks of HCV elimination. Hence, results point to a partial restoration of the adaptive immune response. Regarding liver damage, the elimination of the virus in all cases resulted in a reduction of liver inflammation and a regression of fibrosis stage, indicating a positive effect of DAAs, leading to a generalized liver regeneration despite the evolution of some patients towards hepatocarcinoma. With this premise, it is necessary to look for new tools that allow the early detection of advanced liver diseases. In this sense, miRNAs encapsulated in extracellular vesicles (EVs) are potential diagnostic and prognostic biomarkers, as they provide relevant information of the current state of the patient by using non-invasive methods. However, the lack of a standardized method to discover new biomarkers hinders the application of these tools. Therefore, the objective of the third study was to compare different methods of EVs isolation and miRNA analysis for clinical application. Results showed that iodixanol gradients to isolate EVs and the preparation of libraries with NEBNext Multiplex Small RNA Library kit for next generation sequencing are the most reproducible and accurate methods to detect miRNAs and use it as biomarkers for early detection of diseases resulting from HCV infection.