Study of the neurodegenerative process in Mucopolysaccharidosis type VII and its correction by gene therapy

Abstract

La mucopolisacaridosis tipus VII és un trastorn autosòmic recessiu causat per una deficiència de β-glucuronidasa,(GUSB) que condueix a l'acumulació de glicosaminoglicans dins de les cèl·lules. Les manifestacions clíniques d'aquesta malaltia multisistèmica, crònica i progressiva són molt variables entre pacients, però solen incloure deterioració cognitiva. Encara que alguns dels processos patològics han estat ben caracteritzats en la Mucopolisacaridosis tipus VII, la neurodegeneració que caracteritza aquesta malaltia no és un d'ells. A més, a pesar de que molts estudis preclínics han demostrat que la teràpia gènica és una estratègia amb potencial per a tractar la MPS VII, el seu efecte sobre la patologia neuronal no ha estat analitzat detalladament. Aquest estudi està centrat en comprendre com l'acumulació de glicosaminoglicans en els lisosomes afecta la viabilitat o el funcionament de les neurones. Hem estudiat la pèrdua neuronal i analitzat la densitat d'espines dendrítiques en el model de ratolí de MPS VII utilitzant diferents tècniques d'imatge. A més, per a obtenir una comprensió més completa de la patologia en el sistema nerviós central, també hem analitzat a 1, 3 i 6 mesos d'edat la neuroinflamació, l'estrès oxidatiu i l'autofàgia, mecanismes coneguts per exercir un paper central en la funció neuronal i les malalties neurodegeneratives. Per a comprovar si és possible restaurar les anomalies neuronals després de l'ús de teràpia gènica, s'han tractat ratolins MPS VII a 2 mesos d'edat mitjançant injecció intratecal de AAVrh10-GUSB i s'han analitzat les mostres a 5 i 6 mesos d'edat. Per a complementar els estudis in vivo, hem generat una línia de cèl·lules neuronals inactivant el gen GUSB mitjançant l’ús de la tecnologia CRISPR/Cas9 en cèl·lules SH-SY5Y. Juntament amb cultius primaris de neurones corticals, hem utilitzat aquest nou model per a analitzar més a fons la neuropatologia a nivell cel·lular. Els nostres resultats demostren una afectació diferent entre estructures cerebrals, algunes d'elles mostrant una disminució de la densitat neuronal o de la mida de la capa neuronal en l'última edat analitzada. Les neurones tant en l'escorça cerebral com en l'hipocamp presenten una disminució significativa en la densitat d'espines dendrítiques, suggerint una altra conseqüència de la manifestació neurològica de la malaltia. Els ratolins MPS VII presenten un augment d'astre i microgliosis en tot el cervell i nivells elevats de diverses proteïnes del sistema del complement. La funció neuronal també es troba alterada en la Síndrome de Sly, tal i com ho demostra la reducció de expressió de múltiples proteïnes relacionades amb el correcte funcionament de les neurones. A més, hem descrit un augment de l'estrès oxidatiu, alteracions en la senyalització cel·lular i un flux d'autofàgia deficient que podrien també exercir un paper crucial en la neuropatologia d'aquest trastorn. Un resultat fonamental d'aquesta tesi és la capacitat de la teràpia gènica per a revertir total o parcialment la majoria de les alteracions trobades en l'anàlisi del procés neurodegeneratiu. Si bé encara es desconeix molt sobre els factors que causen i empitjoren la neuropatologia dels pacients amb MPS VII, els nostres resultats proposen diversos mecanismes que poden ser parcialment responsables d'aquest fenotip i una estratègia terapèutica eficaç per a tractar-los amb èxit.

La mucopolisacaridosis tipo VII es un trastorno autosómico recesivo causado por una deficiencia de β-glucuronidasa,(GUSB) que conduce a la acumulación de glicosaminoglicanos dentro de las células. Las manifestaciones clínicas de esta enfermedad multisistémica, crónica y progresiva son muy variables entre pacientes, pero suelen incluir deterioro cognitivo. Aunque algunos de los procesos patológicos han sido bien caracterizados en la Mucopolisacaridosis tipo VII, la neurodegeneración que caracteriza esta enfermedad no es uno de ellos. Además, a pesar de que muchos estudios preclínicos han demostrado que la terapia génica es una estrategia con potencial para tratar la MPS VII, su efecto sobre la patología neuronal no ha sido analizado detalladamente. Este estudio se centra en comprender cómo la acumulación de glicosaminoglicanos en los lisosomas tiene un impacto en la viabilidad o el funcionamiento de las neuronas. Hemos estudiado la pérdida neuronal y analizado la densidad de espinas dendríticas en el modelo de ratón de MPS VII utilizando diferentes técnicas de imagen. Además, para obtener una comprensión más completa de la patología en el sistema nervioso central, también hemos analizado a 1, 3 y 6 meses de edad la neuroinflamación, el estrés oxidativo y la autofagia, mecanismos conocidos por desempeñar un papel central en la función neuronal y las enfermedades neurodegenerativas. Para comprobar si es posible restaurar las anomalías neuronales después del uso de terapia génica, se han tratado ratones MPS VII a 2 meses de edad mediante inyección intratecal de AAVrh10-GUSB y se han analizado las muestras a 5 y 6 meses de edad. Para complementar los estudios in vivo, hemos generado una línea de células neuronales inactivando el gen GUSB utilizando la tecnología CRISPR/Cas9 en células SH-SY5Y. Junto con cultivos primarios de neuronas corticales, hemos utilizado este nuevo modelo para analizar más a fondo la neuropatología a nivel celular. Nuestros resultados demuestran una afectación diferente entre estructuras cerebrales, mostrando algunas de ellas una disminución de la densidad neuronal o del tamaño de la capa neuronal en la última edad analizada. Las neuronas tanto en la corteza cerebral como en el hipocampo presentan una disminución significativa en la densidad de espinas dendríticas, sugiriendo otra consecuencia de la manifestación neurológica de la enfermedad. Los ratones MPS VII presentan aumento de astro y microgliosis en todo el cerebro y niveles elevados de varias proteínas del sistema del complemento. La función neuronal también se encuentra alterada en el Síndrome de Sly, tal y como lo demuestra la reducción de la expresión de múltiples proteínas relacionadas con el correcto funcionamiento de las neuronas. Además, hemos descrito un aumento del estrés oxidativo, alteraciones en la señalización celular y un flujo de autofagia deficiente que podrían también desempeñar un papel crucial en la neuropatología de este trastorno. Un resultado fundamental de esta tesis es la capacidad de la terapia génica para revertir total o parcialmente la mayoría de las alteraciones encontradas en el análisis del proceso neurodegenerativo. Aunque todavía se desconoce mucho sobre los factores que subyacen a la neuropatología de los pacientes con MPS VII, nuestros resultados proponen varios mecanismos que pueden ser parcialmente responsables de este fenotipo y una estrategia terapéutica eficaz para tratarlos con éxito.

Mucopolysaccharidosis type VII is an autosomal recessive disorder caused by a β-glucuronidase (GUSB) deficiency, which leads to the accumulation of glycosaminoglycans within the cells. The clinical manifestations of this multisystemic, chronic and progressive disease are highly variable among patients, but often include cognitive impairment. Although some pathological processes have been well characterized, this is not the case for the neurodegeneration. Preclinical studies have stablished gene therapy as potential strategy to treat MPS VII, reversing different pathological features, but its effect in the neuropathology of this disease has not been analyzed in detail. This study is focused on understanding how glycosaminoglycan accumulation in the lysosomes have an impact on the viability or functioning of the neurons. We studied neuronal loss and analyzed dendritic spine density in MPS VII mice using different imaging techniques. Furthermore, to obtain a comprehensive understanding of the pathology in the central nervous system we have also analyzed at 1,3 and 6 months of age neuroinflammation, oxidative stress and autophagy, mechanisms known to play a central role in neuronal function and neurodegenerative diseases. To test if neuronal abnormalities can be restored after gene therapy, MPS VII mice were treated at 2 months of age by intrathecal injection of AAVrh10-GUSB and analyzed at 5 and 6 months of age. To complement the in vivo studies, we generated a neuronal cell line by knocking down the GUSB gene using CRISPR/Cas9 technology in SH-SY5Y cells. Together with primary cultures from cortical neurons, we used the cell line model to further analyze the neuropathology at the cellular level. Our results show a different affectation among brain areas, some of them showing a decrease in neuronal density or width of the neuronal layer at the last age analyzed. Neurons in both cortex and hippocampus showed significant decrease in spine density, uncovering another cause of the neurological manifestation of the disease. MPS VII mice present increased astro- and microgliosis throughout the brain and elevated levels of several proteins of the complement system. Neuronal function is also impaired in Sly syndrome as showcased by reduced level of multiple neuronal function related proteins. Additionally, we describe increased oxidative stress, altered cellular signaling, and impaired autophagy flux to play a relevant role in the pathology of this disorder. A pivotal result of this thesis is the ability of gene therapy approach to reverse fully or at least partially most of the alterations found in the analysis of the neurodegenerative process. Although much is still unknown about the factors underlying the neuropathology of MPS VII patients, our results provide several mechanisms that may be partially responsible for this phenotype and a viable therapeutic approach to successfully treat them.