Precise writing of human genomes: engineering & characterizing genome editors for programmable DNA integration in human cells

Abstract

Methods for genome engineering have enabled construction of synthetic genomes, therapeutically reprogrammed cells, synthetic organs, and modification of human genomes. Design and discovery of genome editors has enabled programmed small deletions and insertions, however, tools for precise integration of large gene fragments are lacking. Towards this goal, we describe the development of a programmable transposase system that can integrate transgenes of >10kb precisely across cell types. We also describe a method for targeted integration with a refactored lentiviral vector via HDR, and exemplify the potential of targeted tissue delivery of lentiviral vectors via envelope protein pooled screening. We further describe a synthetic evolution platform that can be applied to improve genome editors. Finally, we describe the implementation of a method for whole genome characterization of insertions using long read sequencing, that can enable comprehensive characterization of engineered editors. These methods will enable new operations for therapeutic and biotechnological genome writing, and further development of improved editors.

Les metodologies per a l'enginyeria genòmica han permès la construcció de genomes sintètics, la reprogramació terapèutica de cèl·lules, òrgans sintètics i l'edició d’humans. El disseny i descobriment d'editors genòmics ha possibilitat petites delecions i insercions programades, però encara falten eines per a la integració precisa de grans fragments de gens. Amb aquest objectiu, descrivim el desenvolupament d'un sistema de transposasa programable que pot integrar transgens de més de 10kb de manera precisa en diferents tipus de cèl·lules. També descrivim un mètode per a la integració dirigida mitjançant un vector lentiviral refactoritzat a través de HDR, i exemplifiquem el potencial de la lliurament de teixits objectiu de vectors lentivirals mitjançant la selecció de proteïnes d'envoltura i cribatge simultani. A més, descrivim una plataforma d'evolució sintètica per millorar els editors genòmics. Finalment, descrivim la implementació d'un mètode per a la caracterització completa del genoma de les insercions utilitzant seqüenciació de lectura llarga, que pot permetre una caracterització completa dels editors enginyeritzats. Aquestes metodologies permetran noves operacions per a l'escriptura genòmica terapèutica i biotecnològica, i el desenvolupament futur d'editors millorats.