Exploring the Genome and Links Between Transcriptome and Fatty Acid Profiling of Muscle in Pigs

Abstract

El contingut de greix intramuscular i la composició d’àcids grassos (AG) són paràmetres importants que afecten a la qualitat de la carn, influint en les seves característiques organolèptiques i el seu valor nutricional. Els AGs proporcionats per la dieta o derivats de la lipogènesi de novo es transformen per l’acció de diversos gens, com els que codifiquen dessaturases i elongases d’AGs en teixits lipogènics. En aquesta tesi, es van realitzar diversos estudis a partir de les dades del transcriptoma del múscul porcí (per RNA-Seq) i la seva composició d’AG (per cromatografia de gasos) en porcs retro-creuats (Ibèric x Duroc, BC1_DU). Per tant, en el context del disseny multifactorial, s’apliquen tant enfocs estadístics univariants (treball I i II) com multivariants (treball III). Es van realitzar anàlisis complementaris d’ontologia gènica (OG), concordança, correlació, xarxes i identificació de possibles reguladors (RIF).

En el primer estudi, es van identificar 81 gens diferencialment expressats (DE) entre el transcriptoma muscular de porcs divergents (16 Alt i 16 Baix, A vs. B) per a la relació intramuscular entre els AGs oleic i esteàric (C18:1n-9/C18:0). Les anàlisis funcionals van revelar que la via de senyalització PPAR (PPARG, SCD, PLIN1, i FABP3) estava sobrerepresentada. A més, es van identificar altres gens DE relacionats amb l’energia, el metabolisme de lípids i carbohidrats, i la beta-oxidació mitocondrial dels AGs (ACAD10, ACADVL, ECHDC3, FADS3, ILVBL, i MMAA). Els gens SCD i PPARG van mostrar una expressió més alta en animals del grup A i són gens candidats rellevants que afecten la biosíntesi i la Δ9-desaturació dels AGs. El SCD és un enzim limitant que catalitza la conversió de C18:0 a C18:1n-9, mentre que la inducció de l’expressió SCD pot estar regulada pel receptor nuclear PPARG (un regulador principal de l’adipogènesi). A més, els PUFA poden inhibir la transcripció del gen PPARG, i es va associar amb la relació C18:1n-9/C18:0. A més, dos haplotips formats per set polimorfismes localitzats en el gen SCD van ser associats amb la variació de la relació C18:1n-9/C18:0 i l’expressió del gen SCD.

El segon estudi es va enfocar en l’associació global entre els perfils del transcriptoma de múscul i d’AGs intramuscular. Aquí, vam utilitzar 129 animals BC1_DU amb valors d’expressió de 14.870 transcrits i 36 caràcters relacionats amb els AGs, incloent la composició individual d’AGs, la suma d’AGs (SFA, MUFA, i PUFA), les proporcions d’AGs, i índexs metabòlics d’AGs. Es van detectar un nombre variable de gens associats als caràcters d’AGs (1,022 gens en total amb 21 dels 36 caràcters d’AGs). No obstant, només el 53,52% dels valors d’expressió gènica (547/1022 gens) estaven significativament correlacionats (rang [-0,19 a 0,51]) amb valors fenotípics d’AGs (21 caràcters d’AGs). El nostre anàlisi va revelar diversos gens candidats vinculats a la composició d’AGs en múscul, incloent gens coneguts (per exemple, ACSL1, ELOVL6, FBP1, GOT1, LEP, LGALS12, LPL, MDH1, PLIN1, SC5D, SLC27A1, i TFRC) i nous gens candidats (per exemple, TRARG1, i ARNs llargs no codificants com TANK, ENSSSCG00000011196, i ENSSSCG00000038429). A més, hem identificat reguladors genètics que inclouen factors de transcripció (per exemple, ESRRA i LBX1) i cofactors (NCOA2 i LPIN1) implicats en el metabolisme dels AGs. En conjunt, els gens associats als AGs estaven presents en 75 termes de OG sobrerepresentats, incloent la transducció de senyals, la fosforilació oxidativa, el cicle de citrats (cicle TCA), l’entrada d’àcids grassos de cadena llarga i la via de senyalització PPAR.

Finalment, en el tercer estudi, vàrem realitzar un anàlisi multivariant per integrar els perfils intramusculars d’AGs i l’expressió gènica. En aquest estudi, utilitzem els mateixos 129 porcs BC1_DU amb dades d’expressió de RNA-Seq, però centrat només en 15 AGs. Els resultats van revelar un subconjunt de 378 variables canòniques (13 AGs i 365 gens) que maximitzen la correlació (rang [-0,39 a 0,41]) entre els dos conjunts de dades. En particular, sis AGs (C20:4n-6, C18:2n-6, C20:3n-6, C18:1n-9, C18:0, i C16:1n-7) es trobaven entre les variables més interconnectades de la xarxa. Entre els gens relacionats amb els AGs identificats, diversos estaven relacionats amb el metabolisme dels lípids i/o carbohidrats (per exemple, ADIPOQ, CYCS, CYP4B1, ELOVL6, FBP1, G0S2, HMGCR, LEP, LGALS12, LPIN1, PLIN1, PNPLA8, PPP1R1B, SDHD, SFRP5, SOD3, i TFRC), la qualitat de la carn (GALNT15, GOT1, MDH1, NEU3, i PDHA1) i el transport de molècules (per exemple, EXOC7 i SLC44A2). L’anàlisi funcional amb gens relacionats amb AGs indicava que els termes de 55 OG estaven sobrerepresentats, incloent diversos processos i rutes biològiques, com l’expressió gènica mitocondrial, el cicle TCA, y les rutes de regulació de la lipòlisis en els adipòcits i de senyalització de la insulina. Finalment, l’anàlisi RIF va suggerir la rellevància de sis factors de transcripció (CARHSP1, LBX1, MAFA, PAX7, SIX5, i TADA2A) com a possibles reguladors de l’expressió gènica i la composició intramuscular del AGs.

El contenido de la grasa intramuscular y la composición de ácidos grasos (AG) son parámetros importantes que afectan a la calidad de la carne, influyendo tanto en sus características organolépticas como sobre su valor nutricional. Los AG provenientes de la dieta o derivados de la lipogénesis de novo son transformados por la acción de varios genes, por ejemplo, los genes que codifican desaturasas y elongasas de AG en tejidos lipogénicos. En la presente tesis, se realizaron varios estudios a partir de los datos del transcriptoma del músculo porcino (mediante RNA-Seq) y su composición de AG (mediante cromatografía de gases) en cerdos retrocruzados (Ibérico × Duroc, BC1_DU). Se aplicaron enfoques estadísticos tanto univariantes (trabajos I y II) como multivariantes (trabajo III). Asimismo, se realizaron análisis complementarios como los de ontología génica (OG), concordancia, correlación, redes, e identificación de posibles reguladores (FRI).

En el primer estudio identificamos 81 genes diferencialmente expresados (DE) entre el transcriptoma de músculo de cerdos divergentes (16 altos y 16 bajos, A vs. B) para la ratio intramuscular entre los AG oleico y esteárico (C18:1n-9/C18:0). Los análisis funcionales revelaron que la vía de señalización PPAR (PPARG, SCD, PLIN1 y FABP3) fue sobrerrepresentada. Además, se identificaron otros genes DE relacionados con la energía, el metabolismo de lípidos y carbohidratos, y la betaoxidación mitocondrial del AG (ACAD10, ACADVL, ECHDC3, FADS3, ILVBL y MMAA). Tanto los genes SCD como PPARG mostraron una mayor expresión en los animales del grupo A y ambos son genes candidatos relevantes que afectan a la biosíntesis y la Δ9-desaturación de los AG. SCD es una enzima ratio-limitante que cataliza la conversión de C18:0 en C18:1n-9, mientras que la inducción de la expresión de SCD puede estar regulada por el receptor nuclear PPARG (máster regulador de la adipogénesis). Asimismo, los PUFA pueden inhibir la transcripción de PPARG y también se han asociado con el ratio C18:1n-9/C18:0. Además, dos haplotipos formados por siete polimorfismos localizados en el gen SCD se asociaron con la variación de la ratio C18:1n-9/C18:0, así como con la expresión del SCD.

El segundo estudio se enfocó en la asociación global entre los perfiles del transcriptoma de músculo y de AG intramuscular. Para ello utilizamos 129 animales BC1_DU con los valores de expresión de 14.870 transcritos y 36 caracteres relacionados con la composición de AG, incluyendo la composición individual de los AG, la suma de los AG (saturados, monoinsaturados y poliinsaturados), los ratios entre los AG y los índices metabólicos de AG. Se identificaron un número variable de genes asociados a los caracteres de AG (1.022 genes en total con 21 de 36 caracteres de AG). Sin embargo, sólo el 53,52% de los valores de expresión génica (547/1.022 genes) se correlacionaron significativamente (rango [-0,19 a 0,51]) con valores fenotípicos de AG (21 caracteres de AG). Nuestro análisis reveló varios genes candidatos relacionados con la composición del AG en el músculo, incluyendo genes conocidos (por ejemplo, ACSL1, ELOVL6, FBP1, GOT1, LEP, LGALS12, LPL, MDH1, PLIN1, SC5D, SLC27A1 y TFRC) y nuevos genes candidatos (por ejemplo, TRARG1, y ARN largos no codificantes como TANK, ENSSSCG00000011196 y ENSSSCG00000038429). Además, identificamos reguladores génicos que incluyeron factores de transcripción (por ejemplo, ESRRA y LBX1) y cofactores (NCOA2 y LPIN1) implicados en el metabolismo de AG. En conjunto, los genes asociados a los AG forman parte de 75 términos de OG sobrerrepresentados, incluyendo la transducción de señales, fosforilación oxidativa, ciclo del ácido tricarboxílico (ciclo TCA), entrada de AG de cadena larga y la vía de señalización PPAR.

Finalmente, en el tercer estudio realizamos un análisis multivariado para integrar los perfiles de AG intramusculares y de expresión génica. En este estudio utilizamos los mismos 129 cerdos BC1_DU con datos de expresión de RNA-Seq pero centrado sólo en 15 AG. Nuestros resultados revelaron un subconjunto de 378 variables canónicas (13 AG y 365 genes) que maximizan la correlación (rango [-0.39 a 0.41]) entre ambos conjuntos de datos. En particular, seis AG (C20:4n-6, C18:2n-6, C20:3n-6, C18:1n-9, C18:0 y C16:1n-7) fueron las variables más interconectadas de la red. Entre los genes asociados con los AG identificados varios relacionados con el metabolismo de los lípidos y/o los carbohidratos (por ejemplo, ADIPOQ, CYCS, CYP4B1, ELOVL6, FBP1, G0S2, HMGCR, LEP, LGALS12, LPIN1, PLIN1, PNPLA8, PPP1R1B, SDHD, SDR16C5, SFRP5, SOD3 y TFRC), la calidad de la carne (GALNT15, GOT1, MDH1, NEU3 y PDHA1) y el transporte de moléculas (por ejemplo, EXOC7 y SLC44A2). El análisis funcional basado en los genes relacionados a los AG indicó 55 términos de OG sobrerrepresentados, entre ellos varios procesos y rutas biológicas, como la expresión génica mitocondrial, ciclo TCA, y las vías de regulación de la lipólisis en adipocitos y de señalización de la insulina. Por último, el análisis RIF sugirió la relevancia de seis factores de transcripción (CARHSP1, LBX1, MAFA, PAX7, SIX5 y TADA2A) como posibles reguladores de la expresión génica y de la composición intramuscular de AG.

The intramuscular fat content and fatty acid (FA) composition are important parameters that affect meat quality, influencing its organoleptic characteristics and nutritional value. FAs provided by the diet or derived from de novo lipogenesis are transformed by the action of several genes, like those encoding desaturases and elongases of FAs in lipogenic tissues. In the current thesis, several studies were performed from the pig muscle transcriptome data (by RNA-Seq) and its FA composition (by gas chromatography) in Iberian × Duroc backcross (BC1_DU) pigs. Hence, in the context of multifactorial design, both univariate (work I and II) and multivariate (work III) statistical approaches are applied. Complementary analyses of gene ontology (GO), concordance, correlation, networks and regulatory impact factor (RIF) were performed.

In the first study, we identified 81 differentially expressed (DE) genes between the muscle transcriptome of divergent pigs (16 high and 16 low, H vs. L) for intramuscular oleic-to-stearic (C18:1n-9/C18:0) ratio. These DE genes included 57 down-regulated and 24 up-regulated, and functional analyses revealed that the PPAR signaling pathway (PPARG, SCD, PLIN1, and FABP3) was over-represented. In addition, other DE genes related to energy, lipid and carbohydrate metabolism, and mitochondrial FA beta-oxidation (ACAD10, ACADVL, ECHDC3, FADS3, ILVBL, and MMAA) were identified. Both, SCD and PPARG genes showed a higher expression in H animals and are relevant candidate genes affecting the biosynthesis and Δ9-desaturation of FAs. SCD is a ratio-limiting enzyme that catalyzes the conversion of C18:0 to C18:1n-9, while the induction of SCD expression appears to be regulated by the nuclear receptor PPARG (i.e., master regulator of adipogenesis). Moreover, PUFA was suggested to inhibit the transcription of PPARG gene, and was associated with the C18:1n-9/C18:0 ratio. Also, two haplotypes of seven SNPs located in the SCD gene were associated with the C18:1n-9/C18:0 ratio variation and the SCD gene expression.

The second study was focussed to the global association between muscle transcriptome and intramuscular FA profiles. Here, we used 129 BC1_DU animals with the expression values of 14,870 transcripts and 36 FA-related traits, including individual FA composition, sum of FAs (SFA, MUFA, and PUFA), FA ratios, and FA metabolic indices. We detected a variable number of associated genes across FAs (1,022 genes in total with 21 of 36 FA traits). However, only 53.52% of gene expression values (547/1022 genes) significantly correlated (range [-0.19 to 0.51]) with FA phenotypic values (21 FA traits). Our analysis revealed several candidate genes linked to FA composition in muscle, including well-known (e.g., ACSL1, ELOVL6, FBP1, GOT1, LEP, LGALS12, LPL, MDH1, PLIN1, SC5D, SLC27A1, and TFRC) and novel candidate genes (e.g., TRARG1, and long non-coding RNAs as TANK, ENSSSCG00000011196, and ENSSSCG00000038429). Furthermore, we identified gene regulators including transcription factors (e.g., ESRRA and LBX1) and co-factors (NCOA2 and LPIN1) involved in FA metabolism. Together, FA-associated genes were present in 75 over-represented GO terms, including, signal transduction, oxidative phosphorylation, citrate cycle (TCA cycle), long-chain fatty acid import, and PPAR signaling pathway.

Finally, in the third study, we performed a multivariate analysis for the integration of intramuscular FA and gene expression profiles. In this study, we used 129 BC1_DU pigs with RNA-Seq expression data, but only 15 individual FA phenotypes. Our results revealed a subset of 378 canonical variables (13 FAs and 365 genes) that maximize the correlation (range [-0.39 to 0.41]) between the two datasets. In particular, six FAs (C20:4n-6, C18:2n-6, C20:3n-6, C18:1n-9, C18:0, and C16:1n-7) were among the most interconnected variables in the network. Among FA-correlated genes identified, several were related to lipid and/or carbohydrate metabolism (e.g., ADIPOQ, CYCS, CYP4B1, ELOVL6, FBP1, G0S2, HMGCR, LEP, LGALS12, LPIN1, PLIN1, PNPLA8, PPP1R1B, SDHD, SDR16C5, SFRP5, SOD3, and TFRC), meat quality (GALNT15, GOT1, MDH1, NEU3, and PDHA1), and transport of molecules (e.g., EXOC7 and SLC44A2). Functional analysis with FA-correlated genes indicated 55 GO terms over-represented, including several biological processes and pathways, including mitochondrial gene expression, TCA cycle, regulation of lipolysis in adipocytes and insulin signaling pathways. Lastly, RIF analysis suggested the relevance of six transcription factors (CARHSP1, LBX1, MAFA, PAX7, SIX5, and TADA2A) as putative regulators of gene expression and intramuscular FA composition.