Study of Malassezia species from the skin of dogs and rabbits using routine and advanced molecular methods

Abstract

Els llevats del gènere Malassezia formen part de la microbiota normal de la pell d’una gran varietat d’animals homeoterms. El gènere està format per 18 espècies que s’han aïllat d’animals domèstics, salvatges i d’humans.

Una de les principals característiques del gènere Malassezia és la seva dependència lipídica, la qual és causada per l’absència del gen codificant d’un enzim sintasa d’àcids grassos. Per això, aquests llevats són incapaços de sintetitzar de novo àcids grassos de cadena llarga i depenen de l’hoste com a font externa d’aquests, presentant així predilecció per les àrees sebàcies de la pell. Tanmateix, per cultivar-les són necessaris medis de cultiu específics suplementats amb àcids grassos. Tot i ser part de la microbiota normal de la pell, sota determinades circumstàncies, la població de Malassezia pot incrementar-se i poden actuar com a patògens oportunistes, causant patologies com dermatitis i/o otitis. Aquestes patologies es tracten habitualment amb antifúngics azòlics que inhibeixen l’enzim lanosterol-14α-desmetilasa, relacionat amb la síntesi de l’ergosterol, un dels principals constituents de la membrana cel·lular.

En aquesta tesi, s’ha estudiat la micobiota del conducte auditiu extern de conills sans mitjançant citologia, cultiu, PCR i NGS. L’aïllament d’espècies de Malassezia en lagomorfs és poc freqüent, de fet, Malassezia cuniculi és la única espècie aïllada en conills. La morfologia de les orelles és considerada un factor predisposant per al sobrecreixement de Malassezia. Per això, es van incloure races de conills d’orelles erectes i caigudes. Tanmateix, es van incloure animals de granja i mascotes. Malgrat no obtenir creixement a cap medi de cultiu utilitzat, la presència de Malassezia es va detectar per citologia. Per NGS, Basidiomycota era el fílum més abundant, seguit d’Ascomycota. Malassezia va ser el gènere majoritari i el filotip 131 de Malassezia el taxó més abundant. Malassezia cuniculi es va detectar a totes les mostres. No es van observar diferències significatives entre les dues tipologies d’orelles.

La pododermatitis canina és un trastorn habitual a la clínica veterinària en el qual M. pachydermatis actua freqüentment com a patogen oportunista. En aquest tesi, es va avaluar la variació de la càrrega de Malassezia mitjançant citologia, cultiu, qPCR i NGS en mostres de l’espai interdigital de gossos amb pododermatitis, sans i post-tractament tractament antifúngic. Les mostres de pododermatitis van presentar recomptes més elevats de Malassezia en l’examen citològic, en cultiu i qPCR. Per NGS, Ascomycota era el fílum més abundant en les mostres de gossos sans i post-tractament. No obstant això, el fílum Basidiomycota i M. pachydermatis predominaven en les mostres de pododermatitis. Aquest estudi va demostrar una correlació en la càrrega de Malassezia entre la citologia i la qPCR.

Finalment, donat que els trastorns relacionats amb Malassezia es tracten habitualment amb antifúngics azòlics, les fallades terapèutiques recentment notificades són motiu de preocupació. Alguns estudis han relacionat la resistència a antifúngics azòlics en determinades soques amb mutacions en el gen ERG11. Cal destacar que, de moment, no existeix cap mètode estandarditzat per avaluar la susceptibilitat antifúngica de Malassezia. Per això, qualsevol modificació de les condicions de les probes pot donar resultats de susceptibilitat diferents. En aquesta tesi, es va avaluar la susceptibilitat antifúngica in vitro de soques de M. pachydermatis aïllades de diferents espècies animals, procedents de casos clínics d’otitis i/o dermatitis i d’animals sans. A més, es va seqüenciar el gen ERG11 i es van tipificar les soques mitjançant un anàlisi multilocus de seqüències dels gens D1/D2, ITS, CHS2 i β-tubulina. Els resultats van demostrar una gran variabilitat de seqüències en el gen ERG11, una correlació entre certs genotips i mutacions en el gen ERG11 i una correlació entre mutacions d’aquest gen i la reducció de la susceptibilitat.

Las levaduras del género Malassezia forman parte de la microbiota normal de la piel de una amplia variedad de animales homeotermos. El género está constituido por 18 especies aisladas en animales domésticos, salvajes y en humanos.

Una de las características principales del género Malassezia es su lipodependencia causada por la ausencia del gen codificante para una enzima sintasa de ácidos grasos. Por ello, estas levaduras son incapaces de sintetizar de novo ácidos grasos de cadena larga y dependen del hospedador como fuente externa de estos, presentando así predilección por las áreas sebáceas de la piel. Asimismo, para su cultivo son necesarios medios de cultivo específicos suplementados con ácidos grasos. Pese a ser parte de la microbiota, bajo determinadas circunstancias, la población de Malassezia puede incrementarse y llegar a actuar como patógenos oportunistas, produciendo patologías como dermatitis y/u otitis. Estas patologías se tratan habitualmente con antifúngicos azólicos, que inhiben la enzima lanosterol-14α-demetilasa relacionada con la síntesis del ergosterol, uno de los principales constituyentes de la membrana celular.

En esta tesis, se ha estudiado la micobiota del conducto auditivo externo de conejos sanos mediante citología, cultivo, PCR y NGS. Es poco frecuente el aislamiento de especies de Malassezia en lagomorfos, de hecho, Malassezia cuniculi es la única especie aislada en conejos. La morfología de las orejas se considera un factor predisponente para el sobrecrecimiento de Malassezia, así, se incluyeron razas de conejos de orejas erectas y caídas. Asimismo, se incluyeron conejos de granja y mascotas. A pesar de no obtener crecimiento en ningún medio de cultivo utilizado, la presencia de Malassezia se detectó mediante citología. Por NGS, Basidiomycota fue el filo más abundante, seguido de Ascomycota. Malassezia fue el género mayoritario, pero el filotipo 131 de Malassezia fue el taxón más abundante. Malassezia cuniculi se detectó en todas las muestras. No se observaron diferencias significativas entre las dos tipologías de orejas.

La pododermatitis canina es un trastorno común en la clínica veterinaria en el cual M. pachydermatis actúa frecuentemente como patógeno oportunista. En esta tesis, se evaluó la variación de la carga de Malassezia mediante citología, cultivo, qPCR y NGS en muestras del espacio interdigital de perros con pododermatitis, sanos y postratamiento antifúngico. Las muestras de pododermatitis presentaron unos recuentos más elevados de Malassezia en citología, cultivo y qPCR. Mediante NGS, Ascomycota fue el filo más abundante en las muestras de perros sanos y postratamiento. Sin embargo, el filo Basidiomycota y M. pachydermatis predominaron en las muestras de pododermatitis. En este estudio, se demostró una correlación en la carga de estas levaduras entre la citología y la qPCR.

Finalmente, dado que las enfermedades relacionadas con Malassezia se tratan comúnmente con antifúngicos azólicos, los fracasos terapéuticos recientemente notificados son motivo de preocupación. Algunos estudios han relacionado la resistencia a antifúngicos azólicos en determinadas cepas con mutaciones en el gen ERG11. Cabe destacar que por el momento no existe ningún método estandarizado para evaluar la susceptibilidad antifúngica de Malassezia. Por ello, cualquier modificación de las condiciones de las pruebas puede dar lugar a resultados de susceptibilidad diferentes. En esta tesis, se evaluó la susceptibilidad antifúngica in vitro de cepas de M. pachydermatis aisladas de diferentes especies animales, procedentes de casos clínicos de otitis y/o dermatitis y de animales sanos. Además, se secuenció el gen ERG11 y se tipificaron las cepas mediante un análisis multilocus de secuencias de los genes D1/D2, ITS, CHS2 y β-tubulina. Los resultados mostraron una gran variabilidad de secuencias del gen ERG11, una correlación entre ciertos genotipos y mutaciones en dicho gen, y una correlación entre mutaciones del gen ERG11 y la reducción de la susceptibilidad a los azoles.

The yeasts of the genus Malassezia are part of the normal skin microbiota of a wide range of warm-blooded animals. The 18 species included in the genus have been isolated from different wild and domestic animals but also from humans.

A main characteristic of Malassezia spp. is their lipid-dependency, which is caused by the lack of the gene encoding the fatty acid synthase. Due to this, they are unable to synthetize long chain fatty acids de novo and they rely on the host as an exogenous source of fatty acids. Thus, Malassezia yeasts have a predilection for sebaceous skin sites. Also, specific media with a specific lipid composition are necessary to culture them. Despite being part of the normal skin microbiota, under certain circumstances the population of Malassezia can overgrow and the yeasts may act as an opportunistic pathogen causing Malassezia related diseases such as dermatitis, otitis, and other skin diseases. Malassezia related diseases are commonly treated with azole antifungals that inhibit the lanosterol-14α-demethylase involved in the ergosterol synthesis, a major component of the cell membrane.

In this thesis, the mycobiota of the external ear canal of healthy rabbits was studied using cytology, culture, PCR and NGS. Malassezia species are rarely isolated in lagomorphs. In fact, only Malassezia cuniculi has been isolated in rabbits. The ear morphology has been suggested as a predisposing factor for Malassezia overgrowth and thus, both lop-eared and erect-eared breeds were included. Also, farmed and pet rabbits were included. Although no growth was observed in any of the culture media used, the presence of Malassezia was detected by cytology. The NGS results demonstrated that Basidiomycota was the most abundant phyla in healthy rabbits followed by Ascomycota. Malassezia was the predominant genus, however it was the Malassezia phylotype 131 the predominant taxa in the external ear canal. Malassezia cuniculi was detected in all samples. No significant differences were observed in the results between both ear morphologies.

Canine pododermatitis is a common veterinary disorder in which M. pachydermatis commonly acts as an opportunistic pathogen. Thus, the variation of the Malassezia load in samples from the interdigital fold of dogs with pododermatitis, dogs after antifungal treatment and healthy dogs was studied by cytology, culture, qPCR and NGS. The pododermatitis samples showed a higher population of Malassezia yeasts by cytology, CFU and qPCR. By NGS, Ascomycota was the main phylum in healthy and post-treatment samples while in the pododermatitis samples, Basidiomycota, and M. pachydermatis were predominant. In this study, a correlation between cytology and qPCR was observed.

Also, as Malassezia related diseases are commonly treated using azole antifungals, recent reports of treatment failure represent a major concern. Some studies reported cases of azole resistance associated with mutations in the ERG11 gene, however there is no standardized method to test antifungal susceptibility in Malassezia. Thus, any modification of the test conditions could provide different susceptibility results. In this thesis, the in vitro antifungal susceptibility of strains of M. pachydermatis isolated from different animal species and health status was evaluated and the ERG11 gene was sequenced. Also, multilocus sequence typing was performed using D1/D2, ITS, CHS2 and β-tubulin genes. The study revealed a high diversity in ERG11 sequences, a correlation between certain genotypes and ERG11 mutations, and a correlation between ERG11 mutations and a reduced susceptibility to azoles.