Study of similarities and differences between circulating hepatitis B virus RNA and DNA quasispecies in different regions of viral genome and development of an antiviral gene therapy strategy

Abstract

Al 2019, la Organització Mundial de la Salut (OMS) va estimar que 296 milions de persones a tot el món vivia amb infecció crònica pel virus de la hepatitis B (VHB), amb 1,5 milions de noves infeccions per any malgrat la disponibilitat d’una vacuna segura i eficaç. Tot i l’existència dels anàlegs de nucleòs(t)ids, aquests antivirals no aconsegueixen curar la infecció ni garantitzar que l’hepatopatia no progressi, ja que no eliminen ni interfereixen en l’expressió del ADN circular covalentment tancat (ADNccc) o del ADN viral integrat al genoma dels hepatòcits. La proteína HBx i la transcriptasa reversa viral (RT) són dos elements clau al cicle vital del VHB. La primera, codificada pel gen X del VHB (HBX), juga un paper important en l’estabilitat del ADNccc intrahepàtic i la seva transcripció. La segona, és responsable de què, entre els virus d’ADN, el VHB sigui un dels més variables, ja que es un domini de la polimerasa viral que manca d’activitat correctora d’errors, proporcionant variabilitat genètica durant la transcripció reversa del ARN pregenòmic encapsulat a ADN circular relaxat. Els nivells sèrics de ADN-VHB disminueixen ràpidament amb l’inici del tractament, mentre que els d’ARN-VHB ho fan més lentament. Això permet estudiar les quasispècies (QS) virals a través de l’ARN-VHB circulant en pacients amb tractament, amb nivells inclús indetectables d’ADN-VHB. La QS d’ARN-VHB circulant és dinàmica i genèticament més homogènia a la de l’ARN intrahepàtic que a la del ADNccc. Per aquest motiu, molts dels mecanismes d’inhibició viral basats en teràpia gènica es centren en els transcrits derivats del VHB com a diana principal. Hi ha pocs estudis que hagin analitzat la QS circulant d’ARN-VHB, motiu pel qual existeixen poques dades sobre les seves similituts i diferències amb la QS d’ADN-VHB. Donat que la QS d’ARN-VHB no ha estat sotmesa a un procés de transcripció reversa, és raonable suposar que poden haver diferències significatives entre ambudes QS. Al primer esutdi es va analitzar una regió de l’extrem 5’ del HBX on previament es van identificar regions hiperconservades a l’ADN-VHB circulant, que preteniem confirmar a l’ARN-VHB circulant. Es van comparar ambues QS en un grup de 13 pacients no tractats amb diferents genotips del VHB i graus de gravetat de la malaltia hepàtica observant-se una major complexitat i conservació de la seqüència a l’ADN-VHB. A més, es va confirmar que la majoria de les regiones hiperconservades anteriorment identifiques coincidien amb les revelades a l’ARN-VHB sèric, pel que és possible que també es conservin a nivell d’ARN-VHB intrahepàtic. Al segon estudi, es van comparar ambues QS a la regió de solapament entre l’antigen de superfície i el domini RT de la polimerasa viral (S-RT) del genoma del VHB, utilitzant un conjunt d’índexs de diversitat, similitut i distàncies genètiques. Es va incloure una mostra de sèrum de 12 pacients no tractas. També es va incloure una mostra de seguiment de tres dels 12 pacients. L’anàlisi dels canvis entre ambdues QS ens va permetre observar les tendències evolutives independents de cada QS, que poden ser diferents segons el pacient. Al tercer estudi, es va utilitzar un model in vitro d’infecció celular per comprovar la possible utilitat de la teràpia gènica dirigida a les seqüències hiperconservades esmentades al primer estudi i també confirmades a nivell d’ARN-VHB circulant. Es van probar diversos oligonucleòtids candidats per teràpia gènica basats en LNA Gapmer i small interfering RNA.

En 2019 la Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que 296 millones de personas en todo el mundo vivían con infección crónica por el virus de la hepatitis B (VHB), con 1,5 millones de nuevas infecciones por año, a pesar de la disponibilidad de una vacuna segura y efectiva. A pesar de la existencia de los análogos de nucleós(t)idos, estos antivirales no logran curar la infección ni garantizan que la hepatopatía no progrese, ya que no eliminan ni interfieren en la expresión del ADN circular covalentemente cerrado (ADNccc) o del ADN viral integrado en el genoma de los hepatocitos. La proteína HBx y la transcriptasa reversa viral (RT) son dos elementos clave en el ciclo vital del VHB. La primera, codificada por el gen X del VHB (HBX), juega un papel importante en la estabilidad del ADNccc intrahepático y su transcripción. La segunda, es responsable de que, entre los virus de ADN, el VHB sea uno de los más variables, ya que es un dominio de la polimerasa viral que carece de actividad correctora de errores, proporcionando variabilidad genética durante la transcripción reversa del ARN pregenómico encapsulado a ADN circular relajado. Los niveles séricos ADN-VHB disminuyen rápidamente tras el inicio del tratamiento, mientras que los de ARN-VHB lo hacen más lentamente. Esto permite estudiar las quasispecies (QS) virales mediante el ARN-VHB circulante en pacientes en tratamiento, con niveles incluso indetectables de ADN-VHB. La QS del ARN-VHB circulante es dinámica y genéticamente más homogénea a la del ARN intrahepático que a la del ADNccc. Por ello, muchos de los mecanismos de inhibición viral basados en terapia génica se centran en los transcritos derivados del VHB como diana principal. Pocos estudios han analizado la QS circulante de ARN-VHB, por lo que existen pocos datos sobre sus similitudes y diferencias con respecto a la QS de ADN-VHB. Dado que la QS de ARN-VHB no se ha sometido a un proceso de transcripción reversa, es razonable suponer que puede haber diferencias significativas entre ambas QS. En el primer estudio se analizó una región del extremo 5’ del HBX en la que previamente se identificaron regiones híperconservadas en el ADN-VHB circulante, que pretendíamos confirmar en el ARN-VHB circulante. Se compararon ambas QS en un grupo de 13 pacientes no tratados con diferentes genotipos del VHB y grados de gravedad de la enfermedad hepáticaobservandose una mayor complejidad y conservación de la secuencia en el ADN-VHB. Además, se confirmó que la mayoría de las regiones híperconservadas anteriormente identificadas coincidían con las reveladas en el ARN-VHB sérico, por lo que es posible que también se conserven a nivel de ARN-VHB intrahepático. En el segundo estudio, se compararon ambas QS en la región de solapamiento de superfície/polimerasa (S-RT) del genoma del VHB, utilizando un conjunto de índices de diversidad, similitud y distancias genéticas. Se incluyó una muestra de suero de 12 pacientes no tratados y también una muestra de seguimiento de tres de los 12 pacientes. El análisis de los cambios entre ambas QS nos permitió observar las tendencias evolutivas independientes de cada QS, que pueden ser diferentes según el paciente. En el tercer estudio, se utilizó un modelo in vitro de infección celular para comprobar la posible utilidad de la terapia génica dirigida a las secuencias híperconservadas mencionadas en el primer estudio e incluso confirmadas a nivel del ARN-VHB circulante. Se probaron varios oligonucleótidos candidatos para terapia génica basados en LNA Gapmer y small interfering RNA.

The World Health Organization (WHO) estimated that, in 2019, 296 million people worldwide were living with chronic hepatitis B virus (HBV) infection, with 1.5 million new infections each year despite the availability of a safe and effective vaccine. Although highly effective antiviral treatments with nucleos(t)ides analogues are available, they do not cure the infection or guarantee that the liver disease will not progress because they do not interfere with the expression of covalently closed DNA (cccDNA) or viral DNA integrated into the genome of the hepatocytes. HBx protein and viral reverse transcriptase (RT) are two key elements in the HBV life cycle. The former, encoded by the hepatitis B X gene (HBX), plays an important role in intrahepatic cccDNA stability and its transcription. The latter, is responsible for HBV being the most variable among DNA viruses, as RT is an error-prone HBV polymerase domain that lacks error-proofreading activity and provides genetic variability in catalysing reverse transcription of encapsidated pregenomic RNA (pgRNA) into relaxed circular DNA. Serum HBV-DNA levels decline rapidly after the start of treatment, whereas those of HBV-RNA decline more slowly. It allows the study of viral quasispecies (QS) through circulating HBV-RNA in patients under treatment with even undetectable HBV-DNA. Regarding QS, serum HBV-RNA was dynamic and more genetically homogenous to intrahepatic HBV-RNA than to the cccDNA. For this reason, many of the mechanisms of viral inhibition based on gene therapy approaches are focus on HBV-derived transcripts as the main target. However, few studies to date have analysed circulating HBV-RNA QS and therefore there is little data on its similarities and differences relative to that of HBV-DNA QS. Since HBV-RNA QS has not been subjected to reverse transcription process, it is reasonable to assume that there may be significant differences between HBV-DNA and HBV-RNA QS. According to this, in the first study we analysed a region of the 5’ end of HBX where we had previously identified hyper-conserved regions in the circulating HBV-DNA (9,10), which we also intended to confirm in circulating HBV-RNA. We aimed to compare both serum HBV-DNA and HBV-RNA QS in a group of 13 well-characterised untreated patients with different HBV genotypes and degrees of severity of liver disease, with increased complexity and sequence conservation observed in HBV-DNA. In addition, it was confirmed that most of the previous hyper-conserved regions identified coincided with those revealed in serum HBV-RNA, and may thus also be conserved at intrahepatic HBV-RNA level. In the second study, we aimed to compare similarities and differences between HBV-RNA and HBV-DNA QS in the surface/polymearse (S-RT) overlapping region of HBV genome, using a set of indexes of genetic diversity, similarity, and genetic distances to provide detailed information. A serum sample from 12 untreated patients was included. A follow-up sample of three out of 12 patients was also included. The possibility of analysing changes between both QS allowed us to get an idea of the independent evolutive trends of each viral QS, which may be different according to the patient. In the third study, in vitro functional studies were performed in a cellular infection model to test the potential usefulness of gene therapy targeting the hyper-conserved sequences reported in the first study and even confirmed at circulating HBV-RNA level. Taking all this into account, we tested several candidate oligonucleotides for gene therapy based on LNA Gapmer and small interfering RNA.