Optimization and development of plant virus-based vectors for the synthesis of antifungal proteins of fungal origin (AFPs) and plant defense inducers

Abstract

Existeixen moltes pràctiques comunament utilitzades en la indústria sanitària i alimentària per combatre patògens i plagues, però el pas del temps provoca que algunes quedin obsoletes tot i resultar inicialment efectives. Els patògens desenvolupen resistències, les plagues evolucionen per evadir els tractaments, i els pesticides i els compostos mal utilitzats faciliten l'aparició de soques de microbis resistents. Les noves tecnologies han contribuït al descobriment de biomolècules interessants que podrien contribuir al desenvolupament de tractaments i estratègies innovadores, però l'escassetat de molts d'aquests compostos a la natura en dificulta l'adquisició. Per fer front a aquest problema, la biologia molecular ha desenvolupat l'expressió de gens en sistemes d'expressió heteròlegs per augmentar la producció de compostos valuosos. Un dels sistemes que està guanyant popularitat en els darrers anys explota les plantes com a plataformes de producció, un procés comunament anomenat "molecular farming", que ha estat molt potenciat gràcies a l'ús de vectors d'expressió derivats de virus vegetals. Aquesta tesi es centra en la millora i desenvolupament de vectors virals vegetals per a l'expressió de potents proteïnes antifúngiques d'origen fúngic (AFPs) i d'inductors de defensa de les plantes. Un grup important d'objectius es va centrar en els vectors d'expressió derivats de virus, partint d'un vector prèviament desenvolupat basat en el tobamovirus virus del mosaic del tabac (TMV), que produïa eficientment l'AFP PdAfpB de Penicillium digitatum en l'apoplast de les plantes de Nicotiana benthamiana. En primer lloc, el nostre objectiu va ser millorar aquest vector minimitzant els riscos de rendiments baixos, sovint associats a proteïnes molt actives que tendeixen a interferir amb el metabolisme cel·lular. La compartimentació d'aquestes proteïnes havia servit anteriorment per a reduir la interacció amb compostos cel·lulars, i la presència d'un pèptid de senyalització vacuolar de quitinases de Nicotiana sylvestris (VS), juntament amb un pèptid de senyalització apoplàsic de la proteïna osmotina de N. benthamiana (AP24sp), va augmentar en 9 i 3,5 vegades els rendiments de les AFPs PeAfpA de Penicillium expansum i PdAfpB respectivament, en comparació amb les construccions que només portaven el pèptid de senyalització apoplàsica. Les AFPs produïdes van ser efectives per al control d'infeccions per Botrytis cinerea, Magnaporthe oryzae i Fusarium proliferatum en tomàquet i arròs. Com a objectiu addicional relatiu al "molecular farming", vam provar una espècie de planta alternativa per reemplaçar les plantes relacionades amb el tabac. Les espècies del gènere Nicotiana són excel·lents organismes per a la producció de proteïnes recombinants gràcies al seu ràpid creixement i alta generació de biomassa. Tot i així, les proteïnes produïdes s'han de purificar minuciosament per separar-les de compostos nocius com els fenols i els derivats de la nicotina. Vam desenvolupar un nou vector viral especialment dissenyat per a la producció de proteïnes en Lactuca sativa, una espècie que comparteix moltes característiques bones per a la producció de proteïnes amb el tabac. A més, l'enciam és una planta comestible considerada un organisme GRAS (generalment considerat segur). Un segon grup d'objectius es va centrar en la caracterització de productes amb aplicacions en sanitat vegetal. Les AFPs són petites proteïnes antifúngiques, resistents i molt potents. Afecten els fongs de forma molt específica, cosa que les fa molt atractives per al desenvolupament de tractaments antifúngics. Vam caracteritzar el mecanisme d'acció de PdAfpB, que va resultar en un model d'una proteïna que penetra a les cèl·lules i que desencadena mort cel·lular programada al fong objectiu. Addicionalment, vam estudiar una proteïna present al medi de creixement de P. digitatum, anomenada proteïna secretada rica en cisteïna (SCA), que s'assemblava a una AFP però no presentava activitat antifúngica.

Existen muchas prácticas comúnmente utilizadas en la industria sanitaria y alimentaria para combatir patógenos y plagas, pero el paso del tiempo provoca que algunas de ellas queden obsoletas a pesar de resultar inicialmente efectivas. Los patógenos desarrollan resistencias, las plagas evolucionan para evadir los tratamientos, y los pesticidas y compuestos mal utilizados facilitan la aparición de cepas de microbios resistentes. Las nuevas tecnologías han contribuido al descubrimiento de biomoléculas interesantes que podrían conducir a tratamientos y estrategias novedosos, pero la escasez de muchos de estos compuestos en los organismos que los producen de forma natural dificulta su adquisición. Para hacer frente a este problema, la biología molecular permite ahora la expresión de genes en sistemas de expresión heterólogos para aumentar la producción de compuestos valiosos. Uno de los sistemas que está ganando popularidad en los últimos años explota las plantas como plataformas de producción, un proceso comúnmente denominado "molecular farming", que se ha visto muy potenciado gracias al uso de vectores de expresión derivados de virus vegetales. Esta tesis se ocupa de la mejora y desarrollo de vectores virales vegetales para la expresión de potentes proteínas antifúngicas de origen fúngico (AFPs) e inductores de defensa de las plantas. Un grupo importante de objetivos se centró en los vectores de expresión derivados de virus, comenzando con un vector previamente desarrollado basado en el tobamovirus del mosaico del tabaco (TMV), que producía eficientemente la AFP PdAfpB de Penicillium digitatum en el apoplasto de las plantas de Nicotiana benthamiana. En primer lugar, nuestro objetivo fue mejorar este vector minimizando el riesgo de rendimientos bajos, a menudo asociados a proteínas muy activas que tienden a interferir con el metabolismo celular. La compartimentación de dichas proteínas había servido anteriormente para reducir la interacción con compuestos celulares, y la presencia de un péptido de señalización vacuolar de quitinasas de Nicotiana sylvestris (VS) junto con un péptido de señalización apoplásico de la proteína osmotina de N. benthamiana (AP24sp) aumentó en 9 y 3,5 veces los rendimientos de las AFPs PeAfpA de Penicillium expansum y PdAfpB respectivamente, en comparación con las construcciones que solamente llevaban el péptido de señalización apoplásica. Las AFPs producidas fueron efectivas para el control de infecciones por Botrytis cinerea, Magnaporthe oryzae y Fusarium proliferatum en tomate y arroz. Como objetivo adicional relativo al "molecular farming", probamos una especie de planta alternativa para reemplazar a plantas relacionadas con el tabaco. Las especies del género Nicotiana son excelentes organismos para la producción de proteínas recombinantes gracias a su rápido crecimiento y alta generación de biomasa. Sin embargo, las proteínas producidas deben purificarse minuciosamente para separarlas de compuestos nocivos como los fenoles y los derivados de la nicotina. Desarrollamos un nuevo vector viral especialmente diseñado para la producción de proteínas en Lactuca sativa, una especie que comparte muchas buenas características para la producción de proteínas con la planta del tabaco. Además, la lechuga es una planta comestible considerada un organismo GRAS (generalmente considerado seguro). Un segundo grupo de objetivos se centró en la caracterización de productos con aplicaciones en sanidad vegetal. Las AFPs son proteínas antifúngicas pequeñas, resistentes y muy potentes. Afectan a los hongos de forma muy específica, lo que las hace muy atractivas para el desarrollo de tratamientos antifúngicos. Caracterizamos el mecanismo de acción de PdAfpB, lo que dio como resultado un modelo de una proteína que penetra en las células y que desencadena muerte celular programada en el hongo objetivo. Adicionalmente, estudiamos una proteína presente en el medio de crecimiento de P. digitatum, denominada proteína secretada rica en cisteína (SCA), que se parecía a una AFP pero no presentaba actividad antifúngica.

There are many practices commonly used in health and food industry to combat pathogens and pests, but time renders some of them obsolete despite being initially effective. Pathogens develop resistances, pests evolve to evade treatments, and misused pesticides and compounds ease the emergence of resistant strains of microbes. New technologies have contributed to the discovery of interesting biomolecules that could lead to novel treatments and strategies, but the scarcity of many of these compounds in their naturally producing organisms difficult their acquisition. To cope with this issue, molecular biology now allows the expression of genes in heterologous expression systems to increase the production of valuable compounds. One of the systems that is gaining popularity in the last years exploits plants as production platforms, a process commonly referred as molecular farming, which has been greatly enhanced thanks to the use of plant virus derived expression vectors. In this thesis, we report the upgrade and development of plant viral vectors for the expression of potent antifungal proteins of fungal origin (AFPs) and defense inducers in plants. A major group of objectives focused on the virus-derived expression vectors, starting with a previously developed vector based on the tobamovirus tobacco mosaic virus (TMV) that efficiently produced the AFP PdAfpB from Penicillium digitatum in the apoplast of Nicotiana benthamiana plants. First, we aimed to improve this vector minimizing the risk of reduced yields, often associated to highly active proteins that tend to interfere with the metabolism of cells. Compartmentalization of such proteins has served to reduce their interaction with cellular compounds. The presence of a vacuolar signaling peptide from Nicotiana sylvestris chitinases (VS) together with an apoplastic signaling peptide from the N. benthamiana osmotin protein (AP24sp) raised by 9-fold and 3,5-fold the yields of the AFPs PeAfpA from Penicillium expansum and PdAfpB respectively, compared with using the apoplastic signaling alone. The produced AFPs were effective for the control of Botrytis cinerea, Magnaporthe oryzae and Fusarium proliferatum infections in tomato and rice. As a separate objective in this group, we tested an alternative plant species to replace tobacco relatives. Nicotiana sp. are excellent production scaffolds for recombinant proteins thanks to their fast growth and high biomass yields. However, the produced proteins must be thoroughly purified to separate them from harmful compounds like phenols and nicotine derivatives. We developed a new viral vector especially designed for protein production in Lactuca sativa, which shares many good characteristics for protein production with tobacco plants. Furthermore, lettuce is an edible plant considered a GRAS organism (generally regarded as safe). A second group of objectives were centered in the characterization of products with applications in plant health. AFPs are small, resistant, and potent antifungal proteins. They target fungi very specifically, which makes them attractive molecules for the development of antifungal treatments. We characterized the mechanism of action of PdAfpB, resulting in a model of a cell-penetrating protein that triggered programmed cell death in the target fungus. Additionally, we considered a protein present in the P. digitatum growth media, named secreted cysteine-rich anionic protein (SCA), that resembled an AFP but did not have antifungal activity. However, SCA protected tomato and Arabidopsis plants when applied before pathogenic fungi. Functional and genomic analysis revealed that SCA was acting as an elicitor, inducing a priming state in the plants that conferred resistance to pathogens. Finally, we also demonstrated that crude extracts from plants expressing AFPs or SCA after simple purification steps were equally active as their purified protein counterparts, suggesting that their production using viral vectors in plants could lead to the development of novel and environmentally friendly green bio-fungicides for crop and postharvest protection.