Adaptive evolution and acid tolerance of the wine bacterium Oenococcus oeni

Abstract

Oenococcus oeni és el principal bacteri làctic responsable de la fermentació malolàctica al vi. Aquesta segona etapa de fermentació permet reduir l’acidesa total, aportant rodonesa, suavitat i estabilitat microbiològica als vins. Les condicions fisicoquímiques del vi afecten el desenvolupament dels microorganismes degut a la combinació de diversos factors d'estrès que poden comprometre el bon funcionament de la fermentació malolàctica. Aquest treball es va centrar en l'estrès àcid, amb l'objectiu d’evidenciar els mecanismes implicats en la resposta a l'estrès d'O. oeni. Per a això, es van implementar dos desenvolupaments experimentals per tal d'adaptar els bacteris a un pH baix i millorar així la seva tolerància a l'acidesa. Aquest procés va provocar l'aparició de mutacions que es van identificar mitjançant la seqüenciació del genoma de les poblacions evolucionades obtingudes. El primer experiment realitzat amb la soca ATCC BAA-1163 va revelar la fixació de mutacions dins del locus del citrat que afectaven totes les poblacions evolucionades. Per tant, el metabolisme del citrat a O. oeni va ser objecte d'un estudi en profunditat durant aquesta tesi. Els resultats van demostrar que la modulació de la velocitat del consum de citrat podria reforçar la tolerància a l'acidesa d'O. oeni. Paral·lelament, es van estudiar els mecanismes implicats en la regulació del locus del citrat en aquest bacteri i van revelar el paper del regulador transcripcional CitR i la implicació d'un ARN missatger antisentit. L'estudi del metabolisme del carboni de soques de diferents orígens també va mostrar una gran diversitat entre elles, que es podria correlacionar amb els seus ecosistemes i que reforça el vincle entre el consum de citrat i la tolerància a l’acidesa de les soques. Finalment, una segona evolució experimental realitzada sobre la soca comercial IOEB_S450 va posar de manifest l'aparició de mutacions en diferents gens, inclòs el locus del malat, la qual cosa obre el camí a noves perspectives de recerca.

Oenococcus oeni es la principal bacteria láctica responsable de la fermentación maloláctica en el vino. Esta segunda etapa de fermentación permite reducir la acidez total, aportando redondez, suavidad y estabilidad microbiológica a los vinos. Las condiciones físico-químicas del vino afectan al desarrollo de los microorganismos debido a la combinación de diversos factores de estrés que pueden comprometer el buen funcionamiento de la fermentación maloláctica. Este trabajo se centró en el estrés ácido, con el objetivo de evidenciar los mecanismos implicados en la respuesta al estrés de O. oenio. Para ello, se implementaron dos desarrollos experimentales para adaptar las bacterias a un pH bajo y mejorar así su tolerancia a la acidez. Este proceso provocó la aparición de mutaciones identificadas mediante la secuenciación del genoma de las poblaciones evolucionadas obtenidas. El primer experimento realizado con la cepa ATCC BAA-1163 reveló la fijación de mutaciones dentro del locus del citrato que afectaban a todas las poblaciones evolucionadas. Por tanto, el metabolismo del citrato en O. oeni fue objeto de un estudio en profundidad durante esta tesis. Los resultados demostraron que la modulación de la velocidad del consumo de citrato podría reforzar la tolerancia a la acidez de O. oenio. Paralelamente, se estudiaron los mecanismos implicados en la regulación del locus del citrato en esta bacteria y revelaron el papel del regulador transcripcional CitR y la implicación de un ARN mensajero antisentido. El estudio del metabolismo del carbono de cepas de diferentes orígenes también mostró una gran diversidad entre ellas, que podría correlacionarse con sus ecosistemas y que refuerza el vínculo entre el consumo de citrato y la tolerancia a la acidez de las cepas. Por último, una segunda evolución experimental realizada sobre la cepa comercial IOEB_S450 puso de manifiesto la aparición de mutaciones en diferentes genes, incluido el locus del enfermo, lo que abre el camino a nuevas perspectivas de investigación.

Oenococcus oeni is the wine bacterium responsible for malolactic fermentation in wine. This second fermentation step reduces total acidity, bringing roundness, softness and microbiological stability to the wine. Nevertheless, wine represents a harsh environment for the development of microorganisms, combining several stress factors that can seriously compromise malolactic fermentation. Particular attention was paid to acid stress, with the aim of identifying unknown mechanisms involved in the response of O. oeni to this stress. Therefore, two experimental evolutions were conducted on two different strains of this bacterium to adapt cells to low pH in order to improve their acid tolerance. It resulted in the appearance of mutations that were identified by whole genome sequencing of the evolved populations obtained. The first experiment conducted on ATCC BAA-1163 revealed the fixation of mutations in the citrate locus of all evolved populations. Therefore, citrate metabolism in O. oeni was extensively studied during this PhD. The results highlighted that a modulation of citrate consumption rate can improve acid tolerance of O. oeni. In addition, the mechanisms involved in the regulation of citrate locus expression in this bacterium were explored, revealing the function of the transcriptional regulator CitR and the involvement of an antisense RNA. A study of the global carbon metabolism of strains from different origins also showed a great diversity between them, which could be correlated to their ecosystems and comforted the link between citrate consumption and acid tolerance. Finally, the second adaptive evolution carried out on the commercial strain IOEB_S450 revealed the acquisition of mutations in different genes including the malate locus and opens the way to new research opportunities.