Development of novel therapeutic strategies against NF-kB Pathway in Diffuse Large B-cell Lymphoma

Abstract

Encara que un alt percentatge de limfomes difusos de cèl·lules B grans (LDCBG) poden curar-se amb una combinació de rituximab, ciclofosfamida, adriamicina, vincristina i prednisona, gairebé un terç dels pacients, que corresponen principalment al subtipus de cèl·lules B activades (CBA), no aconsegueix una remissió completa o recau poc després de finalitzar el tractament. Es creu que aquests tumors depenen gairebé exclusivament de la senyalització del factor de transcripció nuclear constitutiu [Kappa]B (NF-[Kappa]B) per a la seva supervivència, un fenomen que s'ha relacionat amb una varietat d'alteracions genètiques que activen de manera aberrant la via de senyalització del receptor de cèl·lules B (BCR) i el de tipus Toll (TLR).

En aquesta tesi doctoral hem avaluat la seguretat i eficàcia de diferents estratègies destinades a abordar la sobreactivació patològica de NF-[Kappa]B al limfoma difús de cèl·lules B grans, amb especial atenció al subtipus CBA, el qual és difícil de tractar. Aquests enfocaments consisteixen, d'una banda, en el bloqueig de la senyalització de TLR mitjançant la inhibició directa d'IRAK1/4 en associació amb el bloqueig de l'activitat de moduladors epigenètics mediada per la inhibició del bromodomini BET i, d'altra banda, inhibició de la senyalització del sistema ubiquitin-proteosoma mitjançant un nou inhibidor covalent de HOIP, la subunitat catalítica LUBAC.

Per això, hem desenvolupat models preclínics innovadors de LDCBG, com ara esferes multicel·lulars organotípiques i un model de membrana corioalantoïdal (CAM) d'embrió de pollastre d'ABC-DLBCL. Amb aquesta tecnologia d'avantguarda, hem demostrat que els inhibidors de BET ofereixen activitats antitumorals i proapoptòtiques sinèrgiques amb l'antagonista d'IRAK en models in vitro i in vivo. Aquest efecte està directament relacionat amb la regulació negativa d'un conjunt de gens regulats per NF-[Kappa]B, amb un impacte predominant en l'expressió de CD44 i MCL-1, amb el consegüent bloqueig de la motilitat cel·lular i desencadenament de la mort de les cèl·lules tumorals. A més, hem desenvolupat un derivat de pirid[2,3-d]pirimidina, CpdA, que pot unir-se eficientment i específicament a HOIP, la qual cosa resulta en la pertorbació de la dinàmica del complex LUBAC i en una alteració de la senyalització de NF- [Kappa]B, exercint una activitat antitumoral selectiva tant en models in vitro com in vivo de LDCBG la patentabilitat dels quals s'està avaluant actualment. Aquests resultats ressalten la importància de la via de NF-kB en el LDCBG i el potencial com a diana terapèutica que presenta, confirmant que HOIP representa una diana terapèutica prometedora contra el CBA-LDCBG, especialment els casos que presenten mutació activadora de MYD88, amb el desenvolupament de noves combinacions terapèutiques com ara la inhibició conjunta d'IRAK1 i IRAK4, i LUBAC la qual podria presentar efectes sinèrgics en el control de la sobreactivació aberrant de la via NF-kB en aquests pacients de forma específica.

Aunque un alto porcentaje de linfomas difusos de células B grandes (LDCBG) pueden curarse con una combinación de rituximab, ciclofosfamida, adriamicina, vincristina y prednisona, casi un tercio de los pacientes, que corresponden principalmente al subtipo de células B activadas (CBA), no logra una remisión completa o recae poco después de finalizar el tratamiento. Se cree que estos tumores dependen casi exclusivamente de la señalización del factor de transcripción nuclear constitutivo [Kappa]B (NF-[Kappa]B) para su supervivencia, un fenómeno que se ha relacionado con una variedad de alteraciones genéticas que activan de manera aberrante la via de señalización del receptor de células B (BCR) y el de tipo Toll (TLR). En esta tesis doctoral hemos evaluado la seguridad y eficacia de diferentes estrategias destinadas a abordar la sobreactivación patológica de NF-[Kappa]B en el linfoma difuso de células B grandes, con especial atención en el subtipo CBA, el cual es difícil de tratar. Estos enfoques consisten, por un lado, en el bloqueo de la señalización de TLR mediante la inhibición directa de IRAK1/4 en asociación con el bloqueo de la actividad de moduladores epigenéticos mediada por la inhibición del bromodominio BET y, por otro lado, en la inhibición de la señalización del sistema ubiquitin-proteosoma mediante un nuevo inhibidor covalente de HOIP, la subunidad catalítica LUBAC. Para ello, hemos desarrollado modelos preclínicos innovadores de LDCBG, como esferas multicelulares organotípicas y un modelo de membrana corioalantoidea (CAM) de embrión de pollo de ABC-DLBCL. Con esta tecnología de vanguardia, hemos demostrado que los inhibidores de BET ofrecen actividades antitumorales y proapoptóticas sinérgicas con el antagonista de IRAK en modelos in vitro e in vivo. Este efecto está directamente relacionado con la regulación negativa de un conjunto de genes regulados por NF-[Kappa]B, con un impacto predominante en la expresión de CD44 y MCL-1, con el consiguiente bloqueo de la motilidad celular y desencadenamiento de la muerte de las células tumorales. Además, hemos desarrollado un derivado de pirido[2,3-d]pirimidina, CpdA, que puede unirse eficiente y específicamente a HOIP, lo que resulta en la perturbación de la dinámica del complejo LUBAC y en una alteración de la señalización de NF-[Kappa]B, ejerciendo una actividad antitumoral selectiva tanto en modelos in vitro como in vivo de LDCBG cuya patentabilidad se está evaluando actualmente. Estos resultados resaltan la importancia de la vía de NF-kB en LDCBG y el potencial como diana terapéutica que presenta, confirmando que HOIP representa una diana terapéutica prometedora contra el CBA-LDCBG, especialmente los casos que presentan mutación activadora de MYD88, con el desarrollo de nuevas combinaciones terapéuticas como por ejemplo, la inhibición dual de IRAK1 e IRAK4, y LUBAC la cual podría presentar efectos sinérgicos en el control de la sobreactivación aberrante de la vía NF-kB en estos pacientes de forma específica.

Although a high proportion of diffuse large B cell lymphomas (DLBCL) can be cured with combination of rituximab, cyclophosphamide, adriamycin, vincristine and prednisone, almost a third of the patients, corresponding mainly to the activated B-cell (ABC) subtype of the disease, does not achieve complete remission or relapse. It is believed that these tumors rely almost exclusively on constitutive nuclear transcription factor [Kappa]B (NF-[Kappa]B) signaling for their survival, a phenomenon that has been linked to a variety of genetic alterations that aberrantly activate the B cell receptor (BCR) and the Toll-like receptor (TLR) signaling pathways. In this PhD dissertation we have evaluated the safety and efficacy of different approaches aimed at targeting the pathological overactivation of NF-[Kappa]B in diffuse large B-cell lymphoma, with a special focus on the activated B-cell, hard-to-treat subtype of the disease. These approaches consist on one hand on the blockade of TLR signalling by direct inhibition of IRAK1/4 in association with BET bromodomain inhibition-mediated impairment of epigenetic reader's activity and on the other on the inhibition of ubiquitin-proteasome system signalling by means of a novel covalent inhibitor of HOIP, the LUBAC catalytic subunit. For this purpose, we have developed innovative preclinical models of DLBCL such as Organotypic multicellular spheres and a chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of ABC-DLBCL. With this cutting-edge technology, we have demonstrated that BET inhibitors offer synergistic antitumoral and pro-apoptotic activities with IRAK antagonist in vitro and in vivo. This effect is directly related to the downregulation of a set of NF-[Kappa]B-regulated genes, with a predominant impact on CD44 and MCL-1 expression, with the consequent blockade of cell motility and triggering of tumor cell death. Additionally we have developed a pyrido[2,3-d]pyrimidine derivative, CpdA, that can efficiently and specifically bind to HOIP, resulting in the perturbation of LUBAC complex dynamic and in impaired downstream NF-[Kappa]B signaling, exerting selective antitumor activity both in In vitro and In vivo models of DLBCL which is currently being evaluated for patentability. These results highlight the importance of NF-kB pathways in DLBCL and the potential as therapeutic target that it presents, confirming that HOIP represents a promising therapeutic target for ABC-DLBCL, specially with activating MYD88 mutation, as new combinatorial treatment tackling both MYD88p.L265P, as for example dual IRAK1 and IRAK4 inhibition, and LUBAC could be developed in the search of synergistic effects which result in the control of the aberrant overactivation of the NF-kB pathway in these specific patients.